15%,在非吸烟或轻度吸烟(≤10包／年或戒烟时间长达1年以上者)的非小细胞肺癌患者组织中的表达率为11.86%,二者在非小细胞肺癌患者组织中的表达率有差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。将非小细胞肺癌按病理类型分为腺癌和非腺癌两大类(非腺癌中包括鳞癌、大细胞癌及其他类型非小细胞肺癌),其中腺癌患者EMLA-ALK基因阳性表达率为14.91%,非腺癌患者的EMLA-ALK基因阳性表达率仅为0.76%,二者之间的差异具有统计学意义(P0.05)。根据患者的临床分期分组,可见低分期组(Ⅰ+Ⅱ期)中EML4-ALK基因的阳性表达率为5.14%,高分期组(Ⅲ
screening assay Ⅳ期)中EML4-ALK的阳性表达率为12.56%,且此种差异具有统计学意义(P
背景与目的: 肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,化疗药物因其毒副作用影响了对肺癌的治疗价值。近年来随着对肺癌发病机制及分子靶向治疗深入研究,人们研究发现80%以上的肺癌患者EGFR高表达,针对EGFR分子治疗的药物有多种,其中EGFR胞内酪氨酸激酶的小分子抑制剂,即EGFR-TKIs在临床研究发现,EGFR-TKIs对于大部分EGFR突变的患者,初始有非常好的疗效,尤其对突变类型为19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变患者,随着药物应用时间的延长,都不可避免的产生耐药。关于获得性耐药的机制主要包括EGFR的T790M二次突变和MET基因扩增,约占70%,尚有30%-40%的耐药机制不清楚,主要有PTEN表达缺失或功能异常、IGF-1R高表达、HGF高表达等。为进一步研究EGFR-TKIs获得性耐药机制,我们利用前期已经诱导成功的耐药细胞株HCC827-TR和敏感株HCC827-P,通过用不同方法对已知EGFR-TKIs获得性耐药机理的筛查。 已知最常见的获得性耐药机制是EGFR的20外显子发生T790M二次突变,而肿瘤的活性仍然依赖EGFR信号传导通路,因此如何阻断EGFR信号传导通路是克服耐药的关键。目前主要逆转耐药的研究包括联合EGFR单抗治疗、不可逆的EGFR-TKIs抑制剂和T790M突变抑制剂。本课题主要对不可逆的EGFR-TKIs抑制剂阿发替尼进行研究。介于H1975和H1650细胞株分别为EGFR外显子21的点突变(L858R)和外显子19的缺失突变(E746-A750del),其中H1975同时伴发外显子20的二次突变(T790M),我们选用H1975和H1650细胞株进行有关实验,初步探讨阿法替尼逆转EGFR-TKIs获得性耐药可能性。
方法： 1.人体外培养HCC827-P、HCC827-TR细胞。提取总RNA,进行反转录成cDNA,通过Realtime-PCR检测二者细胞内PTEN基因mRNA表达水平。 或者 2.Western-blot检测HCC827-P和HCC827-TR细胞中PTEN的表达水平,同时检测经5μM Erlotinib处理2h后的HCC827-P和HCC827-TR细胞中EGFR下游靶蛋白p-AKT表达水平。 3.MTS检测Afatinib和Erlotinib在H1975和H1650细胞系中的毒性作用。 结果： 1. Realtime-PCR检测结果显示HCC827-TR和HCC827-P细胞系中二者的PTEN mRNA表达水平不一致；其中HCC827-TR细胞系的PTEN基因mRNA表达水平较HCC827-P细胞系低。 2. Western-blot检测显示HCC827-TR细胞中PTEN蛋白表达缺失；给予EGFR-TKI抑制剂Erlotinib5μM处理2h后,HCC827-P细胞系的下游信号蛋白p-AKT明显被抑制,未经Erlotinib处理的HCC827-TR细胞中p-AKT水平轻度上调。 所以 3. Afatinib对H1975存在生长抑制作用。当Afatinib和Erlotinib药物浓度均为10μM时,二者对H1975的生长抑制率分别为58%、14%,IC50分别为9.03μM和33.16μM。Afatinib对H1650的生长抑制作用强于Erlotinib,当Afatinib和Erlotinib药物浓度均为0.001μM时,二者对H1650的生长抑制率分别为15%、6%,IC50分别为8.45μM和19.82μM
结论： 1. HCC827-TR对Erlotinib获得性耐药机制可能与PTEN蛋白表达下调导致的p-AKT持续活化有关。 2. Erlotinib可显著抑制HCC827-P细胞内EGFR下游的PI3/AKT信号通路,而对HCC827-TR细胞的抑制作用不显著。 3. Afatinib能够逆转由T790M突变导致的耐药,对于由PTEN蛋白表达缺失或下调引起的耐药也有一定程度的逆转作用。
目的验证新型单抗D5F3结合罗氏Ventana全自动免疫组化机是一种灵敏度及特异度较高的可以用来筛选非小细胞肺癌中药物靶点ALK的候选方法；探讨肺腺癌中ALK融合基因及融合蛋白表达的相关性；检测肺腺癌支气管镜活检标本中ALK融合基因及融合蛋白表达状况及二者与临床病理的相关性。 方法选取细胞株H2228(ALK阳性)及CALU-3(ALK阴性)分别进行荧光原位杂交法及免疫组化法检测；从北京协和医院病理外检标本筛选20例ALK阳性病例进行VANTANA免疫组化染色；筛选230例肺腺癌手术标本制成芯片,分别进行荧光原位杂交及免疫组化法检测；从北京协和医院病理科标本库中筛选65例中晚期浸润性肺腺癌支气管镜活检标本,分别进行荧光原位杂交法及免疫组化法检测。 结果肺腺癌中ALK融合基因和ALK融合蛋白部分不相符；对于活检标本,FISH检测阳性率7.