测定原理为过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合,从而形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰。6 RT-PCR检测p38MAPK、SGK1、NFAT5和HO-1mRNA表达情况首先从脊髓细胞中提取总RNA,鉴定RNA纯度和浓度。应用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。之后采用sybr green法检测扩增变化。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。计算方法是：目的基因相对表达倍数=2-△△C(t),c(t)值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数,根据△c(t)实验组=C(t)目的基因-c(t)ACTIN,△c(t)对照组=c(t)目的基因-c(t)ACTIN,△△c(t)=Δc(t)实验组-△c(t)对照组,对每一标本计算目的基因相对于对照组基因的相对定量结果。即其他各个样品相对于对照样品,目的基因mRNA转录水平的差异。7统计方法采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。实验所测得数据进行正态性检验和方差齐性检验,以“均数±标准差”表示。发病率用用卡方检捡进行统计学分析,以百分比表示。多组计量资料均数的比较：方差齐时应用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q检验进行方差分析,方差不齐时立用非参数秩和检验。以P
研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)源于间叶组织,是以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征的恶性肿瘤,是原发性恶性骨肿瘤中最常见、恶性程度最高的一类骨肿瘤,好发于儿童和青少年期。在手术切除的基础上辅助阿霉素(Adriamycin,
还有 ADR)药物为主的联合化疗是目前临床主要治疗手段。尽管新型辅助化疗的应用极大地提高了骨肉瘤患者的5年存活率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率仍徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞具有自我更新、强致瘤性、多向分化潜能、产生异质性肿瘤细胞及多重耐药性的生物学特征,因此骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是临床化疗失败的关键原因之一。如果可以特异性的针对骨肉瘤肿瘤干细胞,尤其是化疗作用下骨肉瘤肿瘤干细胞相关特性的改变,可为深入认识骨肉瘤的发生发展提供新方向,并以此为基础寻找和发现靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的药物,对于骨肉瘤的最终治愈具有不可估量的前景和价值。本论文通过考察一线化疗药物阿霉素对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,发现人类Kruppel样因子4(K1f-4)是促进骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的重要调控因子,进一步通过研究其调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的作用及其分子机制,进而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药等特性的新的关键因子；最后以Klf-4蛋白为潜在靶点筛选到以辛伐他汀为代表的他汀类药物能够抑制Klf-4蛋白,进而有效地拮抗了阿霉素促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力作用,为骨肉瘤的靶向治疗策略提供全新的思路。第一部分：阿霉素影响骨肉瘤细胞的干细胞特性及肿瘤转移能力的作用及机制研究一.研究目的：虽然包括辅助化疗和新辅助化疗在内的化疗方案的引入极大地提高了骨肉瘤患者的5年生存率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率一直徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是其化疗失败的关键因素,目前针对骨肉瘤化疗与肿瘤干细胞具体关系尚未见报道。本课题旨在研究骨肉瘤一线化疗药物阿霉素(Adriamycin,
ADR)与骨肉瘤肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力的关系,阐明其作用机制,为临床靶向治疗骨肉瘤提供潜在靶点。二.研究方法：SRB法检测骨肉瘤细胞对药物的敏感性；siRNA干扰手段沉默目标蛋白；Western
Screening Library 和 Blotting检测蛋白表达、qRT-PCR检测基因表达；流式细胞术检测干细胞标记物CD133的表达；肿瘤微球形成实验考察细胞的自我更新能力；细胞划痕修复和Transwell小室模型考察细胞迁移运动能力。三.研究结果：1.ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)ADR可抑制骨肉瘤细胞的增殖能力且呈良好的剂量关系和时间关系；2)ADR能够引起KHOS/NP、U2OS和OS20三株骨肉瘤细胞的干细胞标记物CD133阳性表达率增加；3)ADR处理组的骨肉瘤细胞形成sphere的数目明显高于对照组；4)ADR作用能够显著提高骨肉瘤肿瘤干细胞标记物CD 133、ALDHA1和ABCG2的转录水平。2.ADR对骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)ADR处理组的骨肉瘤细胞划痕修复能力显著高于对照组；2)ADR处理组的骨肉瘤细胞迁移至Transwell下室的细胞数目显著高于对照组。3.ADR对干细胞转录因子的影响：1)ADR作用骨肉瘤细胞后能够选择地激活Klf-4的mRNA转录；2)ADR作用骨肉瘤细胞后能够上调Klf-4蛋白表达水平。4.Klf-4对ADR促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)沉默Klf-4能够明显抑制ADR引起的CD133表达增加；2)沉默Klf-4能够明显减少ADR所引起sphere数目增加；3)沉默Klf-4能够明显减少A_DR促进的肿瘤干细胞标记物CD133、 ALDHA1和ABCG2的mRNA表达。5.KIf-4对ADR促进的骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)沉默Klf-4能够抑制ADR引起的骨肉瘤细胞划痕修复能力增强；2)沉默Klf-4能够明显减弱ADR引起的骨肉瘤细胞迁移运动能力增强。四.研究结论：本研究首次发现一线化疗药物ADR能够增强骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力,且这种作用依赖于Klf-4的蛋白水平的上调。本研究从肿瘤干细胞角度为解释患者在接受阿霉素治疗的过程中出现骨肉瘤的复发和转移现象提供了新视角。第二部分Klf-4调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性及转移能力的作用研究一.研究目的：人类Kruppel样因子4(Klf-4)是Spl/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程。与已知的TGF-β一样,Klf-4在不同的遗传背景的细胞中具有癌基因或者抑癌基因的不同功能,而Klf-4对骨肉瘤的调控作用尚未见任何文献报道。第一部分研究显示Klf-4参与调控ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,提示Klf-4可能可以作为靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的潜在靶点,本课题将进一步研究Klf-4在骨肉瘤中的表达水平与其自身恶性程度的可能关系以及其在骨肉瘤干细胞样模型中的表达,并以此为切入点,较为全面地阐明其与骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的相互关系,从而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药的关键因子,为骨肉瘤的治疗提供新的潜在分子靶点,有望进一步推动骨肉瘤的临床治疗。二.