5-14.5d胎龄的小鼠胎儿分禺MEFs,传代培养后选取第3代MEFs制备饲养层,采集4d的小鼠囊胚置于其MEFs饲养层的共培养体系中,经体外培养3-4d,可以获取优质的ICM,这为体内受精囊胚来源ESCs的分离培养奠定了基础。 1.2小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成途径的优化 本研究采用5种化学激活方法即乙醇、乙醇+6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、乙醇+6-DMAP+细胞松弛素B (CB)、SrCl2、SrCl2+CB处理小鼠成熟卵母细胞,通过观察激活卵母细胞第二极体排出情况和核型分析,探讨不同激活方法所得激活卵母细胞染色体倍性的倾向类型,比较不同染色体倍性激活卵母细胞的体外发育能力,筛选有利于形成杂合二倍体孤雌囊胚的激活方法。结果表明：在含有10%乙醇培养液中激活卵母细胞5min的基础上,添加6-DMAP有利于抑制第二极体的排出,促进双原核(2PN)杂合二倍体孤雌胚胎的形成,获取更高的过二细胞阻滞率和桑葚胚/囊胚发育率；采用含有10mM

SrCl2和CB处理卵母细胞4h,也能够获取较多的双原核(2PN)杂合二倍体和较高的桑葚胚/囊胚发育率,因此,以上两种孤雌激活方法适宜用于获取小鼠杂合二倍体孤雌囊胚。 1.3人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚(含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和M Ⅱ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎)的构建 本研究分别研究了CB对生发泡(GV)期卵母细胞去核效果的影响、去除成年小鼠MⅠ期卵母细胞GV的方法选择、新生小鼠生长初期卵母细胞与去核GV期卵母细胞黏合体系的筛选、电融合条件选择以及重构胚化学激活方法的筛选等,旨在构建含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎,用于ESCs的分离。结果表明：预先采用10μg/mL CB溶液处理GV期卵母细胞,0.5%链霉蛋白酶去除GV期卵母细胞的透明带,显微操作仪上去除生发泡,将去除生发泡的GV期卵母细胞与新生小鼠生长初期卵母细胞移入自制凹窝内进行黏合,选择1.5KV/cm-2.0KV/cm的电场强度、40μS的脉冲宽度对黏合细胞进行电击,发生电融合和电激活,获得排出了第一极体的速激核成熟重构卵母细胞。利用显微操作仪将重构卵母细胞的核区移植到去除第一极体的MⅡ期成熟卵母细胞的透明带下,通过电融合使两者发生融合,形成含有两个MⅡ期卵母细胞核的重构卵细胞,再经过对其进行7%乙醇(5min)联合2.5mmol/L6-DMAP http://www.selleck.cn/autophagy.html (4h)(?)勺激活后用于体外培养,可以构建出含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎。 2.小鼠ESCs、pESCs和重构pESCs(?)勺分离、培养与鉴定 2.1小鼠体内受精囊胚ESCs的分离、培养与鉴定 本研究采集13.5d胎龄的胎儿分离MEFs,选取第3代MEFs制备饲养层；分别采用全胚法和免疫外科法从4d胚龄的囊胚中获取ICM,将ICM小团块移到饲养层上进行增殖培养,观察集落形态,并对细胞集落进行多能性鉴定。结果表明：采用全胚法和免疫外科法均能分离得到小鼠ESCs集落,其集落形成率差异不显著(30.26±2.77%vs32.92±4.37%,P>0.05)。两种方法所得ESCs集落具有典型的ESCs形态特征,AKP染色阳性,ESCs的染色体为二倍体,具有正常核型,Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,RT-PCR检测表明ESCs表达多能性基因：Oct-4和Sox-2,

那个 RT-PCR检测显示EB中三个胚层的标记基因(Fgf-5、Bra

T和Afp)均为阳性。 2.2昆明小鼠孤雌囊胚来源pESCs的分离、培养与鉴定 鉴于孤雌囊胚于体外培养时间过长,胚胎难以突破透明带引起囊胚孵化率和贴壁率降低的情况,本研究选用免疫外科法分离单倍体pESCs(源自SrCl2激活卵母细胞4h所得囊胚)和二倍体pESCs(源自10mM Angiogenesis抑制剂 SrCl2+5μg/mL CB激活卵母细胞4h所得囊胚),并对所得细胞进行多能性鉴定,旨在探讨孤雌囊胚染色体倍性对pESCs分离和培养效率的影响,筛选适宜倍性的孤雌囊胚获取pESCs。(?)吉果表明：本研究所得到的pESCs集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定效果。从二倍体孤雌囊胚分离所得pESCs的集落形成率显著高于单倍体孤雌囊胚处理组(13.54±4.43%vs7.17±4.45%,P0.05),分别极显著地高于50U和100U SLO处理组(p重构囊胚来源ESCs裂解液处理组(45.00±4.36个、53.67±3.06个)>孤雌囊胚处理组(35.67±2.52个47.67±4.16个)；TSA和5-Aza-dC的预处理有助于促进雄性MEFs的重编程,但是,在没有ESCs裂解液的诱导作用下,仅采用TSA和5-Aza-dC预处理雄性MEFs并不能获得多能干细胞集落；无ESCs裂解液参与的单纯重编程操作过程和雄性的MEFs裂解液并不能使雄性MEFs发生重编程,因此,促使雄性MEFs发生重编程的物质来源于ESCs的裂解液。 4. ESCs裂解液诱导MEFs重编程所得多能干细胞集落的来源鉴定 采用双重PCR性别鉴定方法对体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源ESCs裂解液诱导雄性MEFs重编程所得到的多能干细胞进行性别鉴定,鉴定所得多能干细胞的来源,判定细胞提取物诱导的重编程体系的可靠性。结果表明：体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs的裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源的ESCs裂解液均能够诱导雄性MEFs重编程为多能干细胞,所得多能干细胞的基因组DNA中具有250bp的Sry基因序列片段和339bp的ZFX基因序列片段,为雄性细胞。因此,pESCs裂解液重编程所得具有多能性特征的细胞是源自于雄性MEFs,它们所表现出的多能性检测指标的阳性反应并不是由于裂解液制备过程中的ESCs污染所致。 5. ESCs裂解液诱导种间体细胞重编程的可行性研究 本研究以鸡胚成纤维细胞作为重编程的受体细胞,采用小鼠体内受精囊胚来源ESCs裂解液与其进行共孵育,通过形态学观察,研究其对鸡胚成纤维细胞的逆转化效果,对所获得干细胞集落进行多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液作用于异种体细胞后,使其重编程逆转化为多潜能干细胞的可行性。结果表明：与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,未见梭形的贴壁细胞,形成了42.33±4.