选择通过PCR扩增后确定的疤痕组织内有变化的PDGF-B作为切入点:

通过免疫组化,RT-PCR,Western Blot,细胞培养,RNA干扰,抗体封闭等技术来研究PDGF-BB在SCI中的作用和可能的作用机制。 【结果】 1.本实验成功建立了OEC、SC、NSC、BMSC和HSC的体外培养方法,并进行了鉴定。 2.运动功能评分:所有大鼠脊髓全横断后,双侧后肢完全瘫痪,不能排尿。大鼠靠前肢拖动身体前行。1周末时,手术损伤组大鼠双后肢开始出现1个后肢关节(踝关节)的轻微活动。细胞移植组则开始出现1或2个后肢关节轻微活动(多为膝关节或/和踝关节)。在第2周末时,手术损伤组和细胞移植组大鼠在细胞移植后排尿障碍均较第1周末时稍有好转,膀胱残余尿仍较多,手术损伤组部分大鼠开始出现2个后肢关节的轻微活动,而细胞移植组部分大鼠开始出现1或2个后肢关节大幅运动。各细胞移植组的大鼠BBB评分在整个恢复的过程中均有明显的提高,但变化最明显的的就是OECs+NSCs组。说明OEC+NSC移植对运动功能恢复明显改善。 因为 3.神经电生理感觉和运动诱发电位检测 3.1 CSEP检测 N1波变化:脊髓全横断组没有测到波形,潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显著;说明手术切断脊髓后上行传导通路明显受损。细胞移植后,OEC、NSC移植组均分别能测到N1波,其与SCI组相比较,有显著性统计学差异(P=0.001,≤0.001、P=0.045,＜0.05)。但OEC+NSC移植组分别与OEC组和NSC组比较,均无统计学差异(P=0.720、0.323,＞0.05)。说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。 P1波变化:脊髓全横断组亦没有测到波形,说明潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显著;然而OEC、NSC移植组能测到P1波,其与SCI组完全消失的情况相比较,差异显著,P=0.001,≤0.001;然而,需注意的是,仅OEC移植组P1波的潜伏期较与假手术组比较明显延长,有统计学差异;而NSC移植组P1波的潜伏期与SCI组相比较,P=0.069,＞0.05,无统计学差异;OEC+NSC移植组P1波的潜伏期与OEC组和NSC组的相比较,P值分别为0.688、0.247,＞0.05,无统计学差异。进一步说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。 3.2 MEP检测: 本实验中,假手术大鼠均能测到明显的诱发电位,这种诱发电位的波幅为均值在6mv左右,潜伏期5ms左右。而SCI后,波幅和潜伏期均测不到,MEP消失。但给予NSC或者OEC移植后,均能测到MEP。只是其潜伏期有些延长(说明传导速度减慢),且恢复波幅明显降低(说明突触功能受损)。细胞联合治疗对MEP没有明显影响。

Pifithrinα 4.植入细胞的存活:脊髓切片上可见到GFP标记的绿色荧光细胞。而联合移植组脊髓既可见绿色荧光细胞,又可见Hochest33342标记的细胞核。标记细胞在损伤脊髓瘢痕,及其上段、下端均可见到。说明移植细胞向头、尾侧迁移,并在宿主脊髓存活。 5.PCR扩增疤痕组织的神经营养因子及其受体,和凋亡相关因子的表达变化发现:①在疤痕组织中均未检测到BDNF、NT-3、bFGF、TrkA、TrkB表达;②NGF各时间点均没有变化。③凋亡基因变化:Bcl-2:在联合移植21d时与NSC移植组比较明显降低,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义;Caspas-3:联合移植组在14d与NSC移植组、OEC移植组相比较,明显增加(P=0.039、0.032,＜0.05),差异有显著统计学意义;但至在21d时,联合移植组与NSC移植组比较Caspas-3表达明显减P=0.006,＜0.01,差异有显著统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Bax在联合移植组14d时与NSC移植比较,明显增加,P=0.031,＜0.05,差异有统计学意义;但至21d时,联合移植组与手术组比较明显减少,P=0.040,＜0.05,差异有统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。④NTF变化:CNTF在联合移植14d时,与OEC移植组及NSC移植比较表达明显增加,P值分别为0.007、0.001、0.023,均＜0.05,差异有显著统计学意义;在21d,联合移植组与NSC移植组比较明显减少,P值为0.000,＜0.01,差异有显著统计学意义;在28d,联合移植组与OEC移植组、NSC移植组比较均明显减少,P值分别为0.028、0.028,均＜0.05,差异有显著统计学意义。IGF-1:在14d时,联合移植组与OEC移植组及NSC移植比较,明显增加,尸值分别为0.003、0.001,均＜0.05,差异有显著性统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异均无统计学意义;PDGF-B:在14d时,联合移植组、OEC、NSC移植与手术组比较,明显减少,P=0.044,＜0.05,差异有统计学意义;联合移植组与NSC移植比较,明显减少,P=0.047,＜0.05,差异有统计学意义。在21d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组及手术组比较明显减少,P=0.039、0.039、0.031,＜0.05,差异有统计学意义。在28d时,联合移植组与OEC移植组之间比较显著减少,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义。TGF-betal:在14d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组和手术组比较明显增加,p=0.001、0.019、0.001,＜0.05,差异有统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Trkc:在14d时,联合移植组与NSC移植组比较,明显降低,P值分别为0.031,＜0.05,差异有统计学意义;在21时,联合移植组与手术组比较(P=0.015,＜0.05),和NSC移植组比较(P=0.010,＜0.05)。差异有统计学意义,而在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。

有 可以看出,PDGF-B是细胞移植促进损伤脊髓修复中变化最明显的分子,提示其可能是细胞移植改进功能可塑性相关的重要分子。 6.OEC+NSC移植对恒河猴SCI功能恢复的影响 6.1后肢运动功能评分:改良的Tarlov’s Method评分结果显示损伤侧、细胞联合移植侧评分均较假手术组明显降低,有统计学差异(P＜0.05)。第1周、第2周、第3周、第4周、第7周,OEE+NSE移植细胞联合移植侧Tarlov’s Method评分均明显高于损伤侧评分,均有统计学意义(P＜0.05)。 6.2移植细胞在宿主脊髓存活和迁移情况:在宿主脊髓可观察到大量荧光细胞,向头端或尾端迁徙;说明移植细胞在宿主脊髓存活,迁移。 6.3神经电生理: CSEP:SCI后各组动物的CSEP信号均消失。损伤侧N1波波幅明显低于损伤对侧,有统计学差异(P＜0.05);而NSC联合OEC细胞移植1个月,细胞联合移植侧N1波幅明显高于损伤侧,有统计学意义(P＜0.