采用SNP诱导软骨细胞凋亡,复元胶囊含药血清干预,ERK1/2的特异性抑制剂U0126及p38的特异性抑制剂SB203580分别阻断ERK1/2及p38信号通路,透射电镜观察软骨细胞凋亡超微结构;流式细胞技术检测软骨细胞凋亡率;免疫印迹技术(Western Blot)检测磷酸化ERK1/2、磷酸化p38、p53蛋白表达水平;硝酸还原酶法检测培养上清中NO水平;比色法观察caspase-3活性。 结果

1.复元胶囊对实验性大鼠膝OA软骨组织形态学的影响 Hulth法造模一月后,关节软骨面开始逐渐出现OA的病理改变,而且随着造模时间的延长而加重。复元胶囊治疗后,大鼠膝OA模型关节软骨的X线影象学积分、大体外观积分、组织学Mankin,s评分均下降,软骨超微结构有明显改善,提示复元胶囊对大鼠实验性OA软骨退变有明显的保护作用。 Epigenetics合成 Library数据表 2.复元胶囊对大鼠实验性膝OA软骨细胞增殖和凋亡的影响 2.1复元胶囊对大鼠实验性OA关节软骨细胞凋亡的影响 造模后的关节软骨在透射电镜下,可以观察到典型的凋亡超微结构。模型组的凋亡指数明显高于正常组,以早期和中期明显,而晚期关节软骨细胞凋亡指数反而下降。复元胶囊治疗后,各组软骨细胞的凋亡指数显著下降,表明复元胶囊对实验性OA软骨退变的保护作用与抑制软骨细胞过度凋亡有关。 2.2复元胶囊对实验性OA大鼠血清中NO水平的影响 模型组大鼠血清NO浓度显著升高,且随着时间的增加而逐渐升高,提示NO参与了OA的病理改变过程。用复元胶囊治疗后,各组大鼠血清NO浓度较造模组明显降低,但高于正常组。 2.3复元胶囊对大鼠实验性OA关节软骨PCNA mRNA表达的影响 正常组关节软骨有PCNA mRNA的表达,在早、中、晚三个时间点变化不大;早期,模型组关节软骨PCNA mRNA表达代偿性增加,复元胶囊组与壮骨关节丸组PCNA mRNA表达低于模型组;中期及晚期,模型组PCNA mRNA表达下降,复元胶囊组与壮骨关节丸组PCNA mRNA表达高于模型组。 2.4复元胶囊对大鼠实验性OA关节软骨Bax、Bcl-2及其比例的影响 正常组软骨表层细胞中有少量Bax阳性表达;模型组全层软骨细胞中均有Bax表达,较正常组有明显升高,而晚期模型组Bax表达较中期模型组反而有所下降。复元胶囊组在软骨各层均有棕色颗粒表达,较同期模型组降低。在早期复元胶囊组与壮骨关节丸组比较无明显差异,在中晚期比较,复元胶囊组比壮骨关节丸组低。 正常组有Bcl-2阳性表达。而模型组Bcl-2阳性表达显著增加,以早期、中期增加最明显。复元胶囊组在软骨各层均有Bcl-2棕色颗粒表达,较同期模型组显著增加。在早、中、晚各期复元胶囊组与壮骨关节丸组比较,差异均无统计学意义。 Bax/Bcl-2比值在模型组明显高于正常组,但比值的增加随时间延长不呈递增趋势。在早期和中期,复元胶囊组和壮骨关节丸组与模型组比较,比值下降;二者在晚期与模型组比较无明显差异。在早、中、晚各期复元胶囊组和壮骨关节丸组比较,比值均无明显差异。 2.5复元胶囊对大鼠实验性OA关节软骨p53 mRNA、caspase-3 mRNA表达的影响 正常组关节软骨p53 mRNA、caspase-3 mRNA表达很少,在早、中、晚三个时间点变化不大。模型组p53 mRNA、caspase-3 mRNA表达与正常组比较明显增加,在早期和中期时尤为明显。复元胶囊组p53

mRNA、caspase-3 mRNA表达明显低于模型组,与壮骨关节丸组比较,表达减少。 3.复元胶囊含药血清对正常软骨细胞增殖和合成代谢的影响不同浓度复元胶囊含药血清促进软骨细胞增殖作用的比较,10%和20%比5%作用明显,而10%与20%比较无明显差异;24 h、48 h、72 h以及96 h四个作用时间点,以48 h时作用最明显。相同浓度下,各时间点复元胶囊含药血清的作用均优于壮骨关节丸。 OSI-744溶解度 培养48 h后,与空白组和空白血清组比较,壮骨关节丸含药血清和复元胶囊含药血清处理后的细胞处于G0/G1的百分比下降,S期及G2/M期的百分比升高,增殖指数(PI)明显上升。三个浓度的复元胶囊含药血清比较,以10%的复元胶囊含药血清作用最明显。 ~3H-TdR和3H-Pro掺入率的变化表明,壮骨关节丸含药血清和复元胶囊含药血清都能促进软骨细胞DNA与Ⅱ型胶原的合成。相同浓度下,复元胶囊含药血清作用比壮骨关节丸强。其中3H-TdR掺入率随浓度增大而呈递增趋势,以20%复元胶囊含药血清作用明显。而3H-Pro掺入率无明显的剂量依赖关系,以10

还有 %复元胶囊含药血清作用明显。 4.复元胶囊含药血清对软骨细胞凋亡ERK1/2和p38信号通路的影响 4.1复元胶囊含药血清对SNP诱导的软骨细胞凋亡的影响 经SNP诱导的软骨细胞在透射电镜下可观察到典型的凋亡形态,包括细胞体积缩小、染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等。复元胶囊含药血清作用于SNP诱导的软骨细胞后,细胞凋亡率明显降低。 4.2复元胶囊含药血清对软骨细胞凋亡ERK1/2信号通路的影响 中药组(复元胶囊含药血清)与空白组和模型组比较, p-ERK1/2蛋白表达增加,培养上清中NO水平降低,p53蛋白表达减少,细胞caspase-3活性被抑制。当用U0126阻断ERK1/2通路后,复元胶囊含药血清仍能降低细胞凋亡率,抑制p53蛋白表达,降低培养上清中NO水平,抑制细胞caspase-3活性,但对p-ERK1/2蛋白表达无明显促进作用。 4.3复元胶囊含药血清对软骨细胞凋亡p38信号通路的影响 中药组(复元胶囊含药血清)与空白组和模型组比较, p-p38蛋白表达减少,培养上清中NO水平降低,p53蛋白表达减少,细胞caspase-3活性被抑制。当用SB203580阻断p38信号通路后,与SB203580组比较,培养上清中NO水平降低,p53蛋白表达下降,细胞caspase-3活性受抑,但对p-p38蛋白表达无明显作用。 结论 1.复元胶囊对Hulth法建立的大鼠膝OA模型关节软骨的X线影象、大体外观、组织学Mankin,s评分、软骨超微结构均有明显改善,对OA软骨退变有明显的保护作用。 2.复元胶囊能抑制大鼠实验性OA关节软骨细胞过度凋亡。 3.复元胶囊能降低大鼠实验性OA模型血清中NO水平,抑制OA模型关节软骨Bax的表达,促进Bcl-2的表达,调节Bax/Bcl-2的比例;促进PCNA mRNA的表达,抑制凋亡因子p53和凋亡执行因子caspase-3 mRNA的表达。 4.复元胶囊含药血清可促进正常软骨细胞增殖,使软骨细胞S期、G2/M期细胞数量增加,PI提高,G0/G1期细胞数量减少。同时,也能提高细胞DNA含量和促进Ⅱ型胶原合成。 5.复元胶囊含药血清能抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡。 6.复元胶囊含药血清通过促进磷酸化ERK1/2表达、降低培养上清中NO水平、调节ERK1/2信号通路下游p53和caspase-3因子而抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡。 7.