0m A,滤板0.25mm Cu和1.0mm Al,靶皮距60cm,剂量率0.40 Gy·min–1;4CCK8(cell counting Kit-8)和集落形成方法检测细胞存活及细胞辐射敏感性;5GFP-LC3细胞模型和MDC染色检测自噬通量(autophagy flux);6Western blot检测蛋白表达水平变化;7免疫共沉淀(IP)检测蛋白间相互作用;8流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果:1.IR诱导自噬和ATM Ser1981位点的磷酸化经过8Gy IR诱导Hela细胞和H1299细胞,Western blot结果显示,MAPLC3-II/MAPLC3-I比值呈剂量依赖性(0Gy,2Gy,4Gy和8Gy)和时间依赖性(4h,8h,16h和24h)增加,其中8Gy IR后16-24h比值最高;Hela和H1299细胞构建GFP-LC3细胞模型,8Gy IR诱导后,细胞中可见明显的自噬空泡;Hela细胞和H1299细胞分别经8Gy IR诱导后,MDC方法检测自噬阳性细胞率分别从17.32%增加到54.77%和7.83%增加到25.93%。以上三种实验结果共同提示IR诱导Hela细胞和H1299细胞自噬激活。同时,Western blot结果显示:与假照组相比,ATM

Ser1981位点的磷酸化在8Gy IR后30min迅速达到最高水平,4h恢复到基础水平。2.抑制ATM下调MAPK14表达进而抑制MAPKAPK2磷酸化在Hela细胞和H1299细胞中构建ATM和MAPK14沉默细胞模型。通过western 已经 blot验证,沉默ATM后,MAPK14表达水平下调,但沉默MAPK14不影响ATM表达水平。同时在H1299细胞中,沉默MAPK14明显下调其下游靶基因MAPKAPK2表达水平。提示MAPK14很可能是ATM下游靶基因之一。另外,ATM抑制剂KU55933在抑制ATM磷酸化的同时使MAPKAPK2磷酸化水平显著下降。提示ATM调控MAPK14-MAPKAPK2信号通路。3.抑制ATM和MAPK14增加辐射敏感性不同剂量IR处理Hela细胞和H1299细胞前2h,分别给予用ATM磷酸化抑制剂KU55933

Rucaparib研究购买 100n M和700n M预处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与DMSO对照组相比,KU55933预处理的Hela细胞和H1299细胞D0分别为3.59 vs 3.02和2.21 vs 1.59,D0值均明显降低。Hela和H1299细胞的ATMRi和MAPK14Ri细胞模型经过不同剂量IR处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与Psuper空载体组比较,D0值分别降低(Hela-ATMRi:2.77 vs 2.13;Hela-MAPK14Ri:2.77 vs 2.19;H1299-ATMRi:2.07 vs 1.44;H1299-MAPK14Ri:2.07 vs 1.52)。以上结果提示,抑制ATM或MAPK14增加辐射敏感性,且两者可能处在调控辐射敏感性的同一个通路。4.抑制ATM和MAPK14不影响IR诱导的凋亡与假照组相比,Hela和H1299沉默细胞模型经8Gy IR处理后24h检测通过流式细胞术检测凋亡水平,空载体Psuper组、ATMRi组和MAPK14Ri组细胞中,凋亡水平均有所增加,分别为8.61%vs 12.5%、8.57%vs

14.08%、9.26%vs 13.88%和6.1%vs 10.2%,5.1%vs 11.8%,5.3%vs 9.8%,但三组之间凋亡水平的增加程度没有差异,提示沉默ATM和MAPK14并没有影响IR诱导的凋亡。5.抑制ATM和MAPK14降低Hela细胞中IR诱导的自噬水平首先在Hela细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。经8Gy IR处理后24h,Western blot检测蛋白表达水平,灰度分析并计算MAPLC3II/MAPLC3I比值。DMSO对照组MAPLC3II/MAPLC3I比值呈剂量依赖性增加(0Gy:1.00,2Gy:1.46,4Gy:1.36和8Gy:1.93),而100n M KU55933提前2h预处理后各组MAPLC3II/MAPLC3I比值(0Gy:1.92,2Gy:2.05,4Gy:2.08和8Gy:1.40)无明显增加。与DMSO组细胞比较,单独KU55933处理使基础MAPLC3比值增加(1.00 无 vs 1.92),但8Gy IR联合KU55933处理使MAPKLC3比值降低(1.92vs 1.40);同时,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组含自噬空泡阳性细胞率增加了124%,而经KU55933预处理后仅增加了34.2%;另外,MDC方法检测自噬阳性细胞率得到类似的结果(202%vs 35.72%)。三种结果共同提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制Hela细胞中IR诱导自噬的水平。然后在Hela沉默细胞模型中进一步验证ATM和MAPK14的作用。8Gy IR诱导后24h,Western blot检测蛋白水平变化。与假照组相比,空载体Psuper组、ATMRi组、MAPK14Ri组细胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分别为1.00 vs 2.71、0.75 vs 0.81和1.19 vs 0.91;同时,MDC阳性细胞率分别增加了为272%,53.18%和24.76%。以上结果表明沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制Hela细胞中IR诱导的自噬水平。6.抑制ATM和MAPK14降低H1299细胞中IR诱导的自噬水平在H1299细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。一方面,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组细胞含自噬空泡阳性细胞率增加了129%,经700n M KU55933预处理后仅增加了29.