5)实验也得到了与8细胞胚胎培养一致的结果：胚胎总细胞数降低,Oct4阳性细胞比例上升,Gata4阳性细胞比例下降。有所不同的是,相比8细胞胚胎,囊胚发育已经进入植入前的最后发育阶段,状态更接近孵化后胚胎,外源因子作用时间较短,所以对囊胚孵化没有产生影响。最后,将上述方法获得的体外胚胎E4.5、E5.5和体内得到的E3.5、E4.5、E5.5、E6.5胚胎分别接种到N2B27+Activin A+bFGF培养液,进行EpiSCs建系实验。体外培养的胚胎和体内获得的E3.5、E4.5胚胎在EpiSCs的培养条件下没有建立EpiSCs细胞系,而体内E5.5和E6.5胚胎利用Activin A/bFGF培养能成功建立EpiSC s细胞系。综上所述,体外培养小鼠8细胞胚胎(E2.5)和囊胚(E3.5)过程中添加WNT、MEK/ERK、LIF/STAT信号通路调控因子,有利于胚胎细胞维持多能性状态。着床前胚胎与着床后胚胎相比,基因表达和转录调节等方面存在巨大差异；同时,体外胚胎与体内胚胎也存在本质差别,虽然体外胚胎能维持epiblast多能状态,但是外源调节因子尚不能弥补体外与体内环境的差异,这些可能是体外培养胚胎与着床前胚胎不能建立EpiSCs细胞系的直接原因。本实验所用的体外培养小鼠早期胚胎的方法,通过添加不同因子调节不同信号通路,很直观的反应不同信号通路对小鼠早期胚胎发育的影响,为今后探索小鼠早期胚胎发育机制提供一定的理论基础。
在本研究的前期工作中,我们获得了一个在转录物组水平处于重编程中间态的稳定细胞系(KMEG-prCs),它具有类似小鼠胚胎干细胞样的细胞形态,并且依赖于饲养层维持其正常的自我更新。然而,其细胞特性和是否具有继续重编程的能力还不清楚。本研究旨在以KMEG-prCs细胞为研究对象,对该细胞的生长特性、基因表达状态、分化能力(类胚体)、多能性基因的甲基化进行了系统分析。结果显示,KMEG-prCs与ESCs、OSKM-iPSCs具有类似的增殖能力。KMEG-prCs能够在体外分化形成类胚体,并具有向内、中、外三胚层分化的能力。在随后的工作中将进一步研究KMEG-prCs的重编程能力,通过不断优化培养条件,推进其继续重编程,获得完全重编程的诱导多能性干细胞,并以此作为深入研究体细胞重编程机理的模型。
目的：通过TGF-β1孵育A549细胞,构建上皮-间质转化发生的研究平台,从体内、体外实验验证益气除痰方可以通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制细胞增殖与侵袭转移的作用。方法：1.将肺腺癌细胞株A549长期暴露在10ng/mL的TGF-β1环境中,诱导其发生EMT,构建肺癌细胞株A549发生EMT的研究平台A549-M。2.通过动物实验,裸鼠皮下分别接种A549细胞和A549-M细胞,建立荷瘤模型,分为A549中药组、A549生理盐水组、A549-M中药组、A549-M生理盐水组,分别给予益气除痰方及生理盐水灌胃21d,记录并统计瘤体体积和体重,第22d处死,称量瘤重,计算抑瘤率。瘤体组织采用Western-blot蛋白检测法检测EMT相关蛋白变化。3.通过细胞实验,MTT法检测不同浓度含药血清对细胞增殖能力的影响；分别给予A549细胞加入空白血清、含药血清TGF-β1(10ng/mL)+空白血清、SB-431542+TGF-β1

selleckchem 因为 购买AC220 (10ng/mL)+空白血清、TGF-β1(10ng/mL)+含药血清的不同处理,相差显微镜下观察各组细胞形态变化；划痕实验、Transwell实验检测各组细胞侵袭转移能力；Western-blot蛋白检测法检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果：1.A549细胞中加入TGF-β1 (10ng/mL) 24h后可出现典型的EMT形态,长期TGF-β1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,撤掉TGF-β1后,形态可维持5d,随传代换液恢复上皮细胞形态。2.动物实验结果显示：①实验结束时,与A549对照组比较,A549中药组、A549-M中药组的瘤重均显著减轻(P<0.01～0.05)；与A549-M对照组比较,A549中药组、A549-M中药组的瘤重也均显著减轻(P<0.01～0.05)。A549中药组、A549-M中药组2组小鼠的抑瘤率分别为31.3%、29.08%。②四组裸鼠肿瘤体积均呈上升趋势,干预第1、3、6天,各组裸鼠肿瘤体积无统计学差异；A549中药组裸鼠肿瘤体积于干预第15天、干预第18天、干预第21天较A549对照组显著减小(P<0.01～0.05),于干预第9天、干预第12天、干预第15天、干预第18天、干预第21天较A549-M对照组显著减小(P<0.01～0.05)；A549-M中药组裸鼠肿瘤体积于干预第12天、干预第15天、干预第18天、干预第21天较A549-M对照组显著减小(P<0.01～0.05),于干预第18天、干预第21天较A549对照组显著减小(P0.05)。体重检测结果提示益气除痰方可以增加裸鼠体重,但与对照组相比不具有统计学意义(P>0.05)。③瘤体Western-blot蛋白检测显示,A549-M对照组裸鼠肿瘤组织中E-cadherin的表达较A549对照组低,Vimentin的表达较之高；A549-M中药组、A549中药组裸鼠肿瘤组织中E-cadherin的表达分别较A549-M对照组、A549对照组低,Vimentin的表达分别较A549-M对照组、A549对照组高；A549-M对照组、A549-M中药组裸鼠肿瘤组织中Smad2/3的表达高于A549对照组及A549中药组,且A549-M对照组表达要高于A549-M中药组。3.