05;前肢上抬实验第3天:治疗组为73.3±30.5%:对照组46.7±33.6%,p＜0.05;前肢应用协调实验第1天:治疗组为26.8±17.2%:对照组47.2±17.4%,p＜0.01。
3结论 脑出血后脑组织内存在长时间的铁离子过载现象,尤其是游离铁水平持续维持在高水平状态,可能是导致长时间铁离子介导的过氧化损伤、出现持久性神经功能损害的重要原因。铁离子螯合剂去铁敏能显著降低大鼠脑出血后脑脊液内游离铁水平,但并不能促进脑组织内总铁水平的下降,由此可以推测,去铁敏主要是通过结合及抑制铁离子活化(游离铁形成)而非促进铁离子外排出脑组织,达到减轻游离铁介导的过氧化损伤作用。脑出血后的铁离子过载与血红素加氧酶(HO-1)表达水平上调显著相关,去铁敏治疗在抑制游离铁水平上升的同时也轻微上调了HO-1的表达,表明去铁敏除了作为游离铁螯合剂外,可能还具有其它神经保护作用。 第二部分丝裂原活化蛋白激酶在大鼠脑出血后继发性脑损伤中的作用及其与铁离子过载关系的实验研究 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛存在于哺乳动物细胞的胞质中,参与调节细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等一系列生命活动;目前研究得最广泛的是ERK1/2、JNK和p38 而且 MAPK三种MAPK。大量研究发现在各种脑退行性疾病(诸如脑淀粉样变性、Alzemer’s病等)以及缺血性脑卒中、蛛网膜下腔出血的脑损伤反应过程中,均有上述三种MAPKs激活的身影,而采用ERK1/2、JNK或p38 一般 MAPK抑制剂能拮抗缺血再灌注损伤所诱导的细胞凋亡和神经元损伤。但是,有关MAPKs激活与否及其在另一种常见的脑血管意外——脑出血中的作用则鲜有报道。此外我们先前的研究已证实铁离子过载尤其是游离铁的积聚是大鼠脑出血后继发性脑损伤以及神经功能损害的重要因素,然而由铁离子介导的脑出血后继发性脑损伤的细胞内信号途径目前并不清楚,铁离子是否能激活脑出血后MAPKs信号通路表达及其作用效应尚需要得到实验的证实。本研究将对脑出血后MAPKs的激活情况及其与铁离子过载之间的关系进行探讨。 1材料和方法 (1)实验动物及分组:本研究采用随机对照动物实验,采用清洁级Sprague-Dawley雄性成年大鼠36只,体重300g～350g。研究分为两个部分,第一部分探讨成年大鼠脑出血后脑组织MAPKs激活状态及变化情况;第二部分探讨铁离子对MAPKs激活的作用以及铁离子螯合剂去铁敏干预治疗对MAPKs激活的影响。
(2)大鼠脑出血后脑组织MAPKs激活状态及变化的研究:该部分对照组为生理盐水脑内注射组(n=3),实验组为脑出血组(n=9)。大鼠自体血注入脑出血模型的建立办法参见摘要第一部分。在对照组中,除采用等量生理盐水取代自体血以外,其余操作相同。模型建立成功后,分别于术后1、3、7天随机处死实验组大鼠,每时相位点各3只大鼠。应用蛋白印迹分析检测脑组织内磷酸化MAPKs表达水平变化。 (3)铁离子对MAPKs激活的作用以及去铁敏干预作用的研究:该部分对照组为生理盐水脑内注射组(n=6),实验组为脑出血组(n=12)和氯化亚铁(Fecl_2)脑内注射组(1mmol/L,n=6)。大鼠自体血注入脑出血模型的建立办法参见摘要第一部分。在对照组中,除采用等量生理盐水取代自体血以外,其余操作相同;氯化亚铁(Fecl_2)脑内注射组先行将Fecl_2溶解于用生理盐水,制备成1mmol/L溶液,然后将30μl
1mmol/L Fecl_2注入大鼠脑内,注射方法同脑出血模型建立方式。对脑出血组再随机分成两组(n=6),一组给予去铁敏治疗(100mg/kg,腹腔内注射,出血后2小时给药,随后间隔12小时给药一次),另一组给予同等量的生理盐水(给药方式同去铁敏组)。各组模型均于术后1天处死,分别采用蛋白印迹分析及免疫组织化学方法检测磷酸化ERK1/2、JNK和p38 MAPK蛋白表达,每组各3只。 (4)蛋白印迹分析(Western Blot Analysis) 蛋白印迹分析步骤参考第一章摘要,采用的一抗分别有的Mouse anti-phospho-ERK1/2(1:1000),Rabbit anti-phospho-JNK(1:1000)以及Rabbit 并且 anti-phospho-p38MAPK(1:1000)的稀释液,二抗分别选用的1:2000稀释液的过氧化物酶共轭的山羊抗兔抗体或兔抗鼠抗体。抗原抗体复合物通过化学发光系统而显影,应用Kodak X-OMAT胶片摄片。条带的相对密度应用NIH Image(Version 1.61)分析。 (5)免疫组织化学分析(Immunohistochemistry Analysis) 免疫组化分析步骤参考第一章摘要,应用亲和素-生物素复合物法进行检测,采用的一抗分别有的Mouse anti-phospho-ERK1/2(1:200),Rabbit anti-phospho-JNK(1:200)以及Rabbit anti-phospho-p38 MAPK(1:200)的稀释液,二抗分别选用的1:400稀释液的生物素化山羊抗兔抗体或兔抗鼠抗体。阴性对照采用正常兔IgG或缺失一抗的办法。 2结果 (1)实验大鼠生理参数:所有实验大鼠的生理参数在术前及术后1小时立即进行检测。平均动脉压、血PH、PaO_2、PaCO_2、红细胞压积(Hematocrit,Hct)以及血糖均控制在正常范围(平均动脉压:70～100mmHg、血PH:7.4～7.