应用滤过性手术建立兔滤过道瘢痕化动物模型,选用24只健康新西兰白兔作为实验动物,随机分为3组：对照组、ALK5组、0.5mM SB-431542组。在全身麻醉下行左眼滤过性手术。术后观察、测量眼压(intraocularpressure,IOP)。术后第3、7、14、28天4个时间点各处死每组2只实验兔,摘除眼球,制作切片,免疫组化染色,光镜下观察滤过道α-SM-actin、ALK5及瘢痕化情况。2.对30只健康的新西兰白兔施行右眼滤过性手术。随机分为5组,对照组(NS+NS)、阴性对照组(NS+0.5mM SB-431542组)、高表达组(ALK5转染+NS)、高表达+低剂量给药组(ALK5转染+0.5mM SB-431542组)和高表达+高剂量给药组(ALK5转染+2.0mM SB-431542组),每组6只兔(6只眼,n=6)。术后观察并测量眼压。术后第28d处死实验兔,摘除实验眼,制作切片,免疫组化染色,检测a-SM-actin、ALK5及瘢痕化情况。
ISRIB订购 结果： 第一部分：贴壁法培养的人结膜下Tenon’s囊组织,约3-5天可见组织块周围爬出梭形细胞,继续培养逐渐汇合成片,经传代后进行波形蛋白(vimentin)染色,鉴定为成纤维细胞。TGF-β1诱导HTF后,ALK5的mRNA表达有所上调,于12-24h达到高峰值。Western Blot显示蛋白表达水平也有所升高,于24-36h达到高峰值。细胞免疫荧光染色检测也同样显示,ALK5表达水平升高。 第二部分：实验成功构建了过表达ALK5基因的慢病毒载体,并获得了较高滴度的病毒液。采用慢病毒转染HTF细胞后,观察发现细胞增殖速度明显增加,并伴有凋亡现象,加入SB-431542后细胞生长速度及凋亡现象均有所逆转。MTT实验显示,转染GFP病毒的细胞与未转染的HTF细胞增值速度无明显变化,转染ALK5病毒的HTF细胞,增殖速度明显增加,而在培液中加入SB-431542后,细胞增殖速度明显降低。转染后,过表达ALK5的细胞,表达a-SMA以及FN蛋白水平有所下降,而加入ALK5抑制剂SB-431542后,该过程可被抑制。 点击此处 第三部分：1.兔滤过性术后术眼的眼压各组均有所下降,术后第1天,平均IOP为5.63±1.73mmHg,P0.05。之后兔眼眼压稍有上升趋势,术后28d,眼压相对术前稍有上升,为12.40±1.16mmHg,P
研究目的：
1.阐明P44/WDR77在肿瘤细胞生长过程中的重要作用 2.研究肿瘤细胞及增生活跃的细胞逃逸TGFβ生长抑制作用的机制 研究方法： 通过慢病毒表达针对P44的shRNA而抑制其正常表达。本实验所涉及的不同的肿瘤细胞系均在表达非靶向shRNA或者P44shRNA后,以2000/孔的密度铺24孔板,每天计数,持续7天,得到生长曲线。通过Western Blot法检测P44, HSP90β, actin, c-Myc, c-Jun, Smad3, Smad3-pS425等目的蛋白的表达情况。通过DNA microarray和RT-PCR方法了解TGF β信号通路下游目的基因的表达情况。构建包含有4个串联Smad反应元件(SBE, GTCTAGAC)的荧光素酶报告质粒(pGL3-4xSBE-E4-luc),使用PC3细胞进行报告基因检测。免疫染色法检测小鼠肺组织切片,全层皮肤切片以及人肺癌组织切片中P44, TGFβ, TβRⅡ以及Smad3的表达情况。 结果： 1.抑制P44的表达能够明显抑制多种肿瘤细胞的生长,包括：肺癌(A549),前列腺癌(PC3),胰腺癌(ASPC-1,
PANC-1),乳腺癌(MDA MB231),结肠癌(HCT116)及黑色素瘤(WM2664)； 2.抑制P44的表达能够明显导致Smad2/3的磷酸化及向细胞核内的转运,TGFβ通路的部分目的基因的转录活性提高,同时TGFβ2和TGFβ RⅡ的蛋白表达量也明显升高； 3.在A549细胞中,当培养基中TGFβ2的浓度达到0.1ng/ml时可以观察到明显的Smad3向细胞核内的转运现象。但是当A549细胞的P44表达被抑制后,TGFβ2的浓度只需要0.001ng/ml即可观察到相同的现象。随着P44表达的抑制,TGFP2对于A549和PC3的生长抑制效应也得到了明显的增高； 而且 4.在小鼠皮肤再生过程中,P44的表达从第5天起明显升高,和角质细胞的增殖相一致。而当在切口愈合后(第7天后),P44的表达逐渐局限于基底部,此时也只有这部分的细胞处于增殖状态。在整个切口全层均能发现TGFβ的存在,但是在P44表达的增殖活跃区域,Smad3并未向核内发生聚集。而在不表达P44的区域,可以看到TβRⅡ的表达以及Smad3向细胞核内转运的情况； 5.对肺癌组织切片染色,发现P44在恶性增殖部分高表达,而在正常的肺组织结构中未表达。在正常区域和增生区域均有TGFP的表达,但是TβRⅡ的表达以及Smad3的核内聚集现象在正常区域更加明显。 结论： 1.P44/WDR77的表达是多种肿瘤生长所必须的； 2.抑制P44/WDR77的表达能够激活TGFβ信号通路,并且P44/WDR77的表达通过抑制TGFβ2和TβRⅡ的表达而限制了TGFβ信号通路的作用； 3.