hy926,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用MTT法确定细胞的增殖状态。 2.体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用不同终浓度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。 3.在96孔板上体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用CCK-8法确定细胞的增殖状态。 4.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用不同终浓度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。
Tie2 信号通路 研究结果 1.采用MTT法确定人脐静脉血管内皮细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.909±0.012, CLZ10μmo/L组0.904±0.026; CLZ30μmol/L组0.851±0.023; CLZ100μmol/L组0.670±0.013; CLZ300μmol/L组0.651±0.036。统计分析显示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分别能明显抑制HUVECs的增殖(P0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(86.7±1.6,77.9±2.3,P
研究目的:
本课题拟以人皮肤微血管内皮细胞株(human dermal microvascularendothelial cells,HMVECs)为研究对象,应用细胞生物学、单层内皮细胞通透性的测定、免疫印迹和激光共聚焦显微镜观察等实验方法和技术,观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)修饰的人血清白蛋白(humanserum ICG 001 albumin,HSA)对HMVECs骨架纤维状肌动蛋白(filamentous actin,,F-actin)形态和定位的影响,以及对单层细胞通透性的作用;选用RhoA的主导失活或组成型激活的重组腺病毒以及ROCK抑制剂处理细胞,探讨Rho/ROCK通路是否参与了AGE-HSA介导的上述细胞反应;通过免疫印迹检测RhoA和ROCK蛋白及其磷酸化水平的变化,查明RhoA、ROCK的磷酸化激活在其中的作用;为了探讨Rho/ROCK介导AGE-HSA引起内皮细胞形态和功能变化的机制,分别观察了抑制ROCK对p38 MAPK磷酸化水平的影响,以及抑制p38 MAPK磷酸化激活对RhoA、ROCK磷酸化激活的影响。通过上述研究试图阐明AGE-HSA对血管内皮细胞形态和功能的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGE-HSA相关的糖尿病微血管并发症发生发展的机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。 研究方法: AGE-HSA由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。体外培养人皮肤微血管内皮细胞株,分别接种于微孔小皿(petri dish)、双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5 mm,孔径大小0.4μm)和6 cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合后,换无血清培养基继续培养2 h使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。在各实验分组中,分别用ROCK特异性抑制剂Y-27632、H-1152或p38MPAK丝裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制剂SB203580预处理细胞30 Wnt抑制剂 min后,即以不同时间或者浓度的AGE-HSA再孵育;另外,用重组腺病毒RhoA N19的无活性型突变体预转染内皮细胞24 h,继以AGE-HSA再孵育;或重组腺病毒RhoA L63的活性突变体单独转染细胞24 h。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin、RhoA及其磷酸化蛋白的结构及分布改变;用免疫印迹法检测phospho-p38,RhoA和ROCK及其磷酸化水平的变化,采用多功能蛋白组学影像系统KODAK2000R直接成像,以ImageJ软件分析各组灰度值,β-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较;用FITC荧光标记蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,实验结果以Pa变化百分比表示,Pa%=(实验样品Pa值/对照样品Pa值)×100。
研究结果: 1.AGE-HSA对HMVECs骨架F-actin形态和单层内皮细胞通透性的影响 (1) AGE-HSA对HMVECs细胞骨架F-actin形态的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs骨架肌动蛋白F-actin结构和分布的改变,未经修饰的人血清白蛋白无此作用;正常细胞的F-actin主要分布在细胞周边,线条光滑,完整连续,界限分明。随着AGE-HSA作用时间或浓度的增加,F-actin变得毛糙不规整,出现锯齿样结构,甚至断裂、变细、崩解消散,F-actin在细胞内弥散分布,由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维逐渐增多,细胞变圆、明显回缩,相邻细胞互相解离,细胞间失去正常连接结构。 (2) AGE-HSA对HMVECs通透性的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs通透性的升高。在时间效应组中,HMVECs的通透性随AGE-HSA作用时间的延长显著增高(F=186.746,P＜0.01),当AGE-HSA作用1,2,4,8,12 h时,与对照组相比,HMVECs的通透性分别增至113.97±2.68%,149.31±2.48%,169.76±6.21%,191.32±2.14%,196.14±2.43%,且从2 h起,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。在剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,HMVECs的通透性显著增加(F=344.582,P＜0.01),对照组内皮细胞的通透性为100%,当AGEs为12.5,25,50,100μg/ml时,Pa与对照组相比分别增至117.95±0.99%,152.15±4.51%,191.32±2.14%,199.23±2.54%,且从12.5μg/ml起均与对照组有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。未经修饰的HSA对内皮细胞通透性(101.57±1.29%)无明显影响,差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.