01),W-7干预组表达减少,呈剂量依赖性(P＜0.05,P＜0.01)。 第二部分PTZ诱导的癫痫大鼠发作程度为Ⅳ-Ⅴ级,W-7保护组发作程度明显减轻,表现为Ⅰ-Ⅲ级发作(P＜0.05)。PTZ组脑组织LDH含量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),W-7保护组同PTZ组比较,LDH含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组织化学染色和免疫印记实验显示,PTZ组caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达明显增强(P＜0.01),三个剂量的W-7组表达明显减弱,其差异均具有显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。 结论 1 NMDA导致体外培养的乳鼠大脑皮质神经元NF-κBp65、p38MAPK蛋白表达增高,促进神经元凋亡。
2不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7可减轻NMDA诱导的皮质神经元的损伤,具有保护作用,其作用机制是通过抑制NF-κBp65、p38MAPK的蛋白表达实现的。 3 PTZ导致癫痫大鼠模型脑组织中caspase-3、NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达增高,提示PTZ癫痫模型可导致以凋亡为主的神经元损伤。 4不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7对PTZ诱导的癫痫大鼠具有保护作用,其作用机制是通过抑制caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK的蛋白表达实现的,可干预癫痫的发生和发展过程。
糖尿病(DM)是一种多病因的慢性代谢性疾病,糖尿病血管病变(DA)是糖尿病的一个重要并发症,是糖尿病病人各种器官病变的基础。DA可累及各级血管,表现为大血管过早发生动脉粥样硬化,血管舒缩功能障碍,血管平滑肌增生,微循环障碍,微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等。在良好的控制血糖水平的基础上,以DA发生发展的机制为切入点,选用药物阻断或减少加重DA发展的病理性因子或产物,成为目前防治DA的新热点。国外从细胞信号转导机制方面研究DA的发病机理,认为高血糖造成血管损伤的可能机制主要有:①多元醇旁路的激活,使代谢产物山梨醇增多,在细胞内积累,引起细胞渗透性损害和肿胀;②蛋白激酶C(PKC)激活,可对血管组织产生一系列不良效应,引起血管的结构与功能改变,与DA及其他糖尿病慢性并发症的发生密切相关;③蛋白质非酶糖化,形成AGEs,使胶原降解减少,基质增加,基底膜增厚,血管壁弹性减低,阻力增加,管腔狭窄;④氧化应激水平升高,对氧化损伤易感性增加,构成糖尿病患者在高血糖时发生慢性血管并发症的基础。西药治疗主要有PKC抑制剂、AGEs形成的抑制剂、醛糖还原酶活性抑制剂、抗氧化剂,上述药物的研发绝大多数还处在实验室阶段,其安全性和有效性还需动物和临床实验进一步证实。
许多 现代中医学者认为痰瘀互结是形成DA的主要原因,中医辨证主要分:气阴两虚型和阴阳两虚型;认为痰浊瘀血贯穿于DA发病的始终,活血化瘀,化痰散结是中医治疗DA的一个基本法则。川芎嗪(TMP)是从具有“血中气药”之称的活血化瘀中药川芎中提取出的有效单体,目前在临床上广泛用于治疗兼有血瘀证候的各种疾病,包括DA。 血管平滑肌细胞(VSMCs)是构成血管的主要细胞,其增殖导致血管重构,管腔变窄以及血管舒缩调节功能异常,是DA的主要病理改变之一。大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))在VSMCs上最为丰富,对平滑肌静息张力的维持和舒缩活动中起重要的调节作用。文献报导TMP可以直接显著增加VSMCs上的BK_(Ca)通道开放概率、缩短关闭时间,是TMP扩张血管的重要机制。此外TMP还能抑制体外培养的VSMCs增殖,促进其凋亡,降低抑制凋亡的相关基因c-myc的表达,使VSMCs处于G1期的细胞数显著增多,S期和G_2+M期的细胞数显著减少。TMP促进VSMCs凋亡与其开放BK_(Ca)通道之间是否存在关联,国内外目前鲜见此方面的研究报道,因此设计了本实验,并试图探讨TMP促进VSMCs凋亡的可能信号转导机制。
还有 目的:从整体水平观察TMP对糖尿病早期大鼠胸主动脉VSMCs上BK_(Ca)通道的作用,对凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响;从细胞水平研究TMP对VSMCs增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其促进BK_(Ca)通道介导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。 方法:采用链脲佐菌素(STZ)一次性大剂量腹腔注射,造成大鼠糖尿病模型。将大鼠分为正常对照组、DM模型组、TMP低剂量组、TMP高剂量组。正常对照组和DM模型组均每日腹腔注射注射用水;TMP低、高剂量组分别每日腹腔注射TMP 40mg/Kg,80mg/Kg。连续用药8周后,每组处死部分大鼠,取胸主动脉,采用原位杂交法检测胸主动脉VSMCs上c-myc、Bcl-2、Bax表达。剩余大鼠分批处死,取胸主脉,酶分离法,急性分离出单个血管VSMCs,采用细胞贴附式膜片钳记录模式,记录细胞上BK_(Ca)通道的开放电流,平均开放概率(NP_o),平均开放时间(T_o)、平均关闭时间(T_c)。体外培养胸主动脉VSMCs,PDGF-BB诱导细胞增殖,分别或联合加入TMP和BK_(Ca)通道开放剂NS1619,用MTT法检测两药对VSMCs生长的影响;另外对培养的细胞进行分组,分别或联合加入BK_(Ca)通道开放剂、阻断剂、一氧化氮供体、p38阻断剂、PKC抑制肽、TMP等,通过Hoechst33342荧光染色,计算VSMCs的凋亡率,经统计学处理后,对比上述药物对VSMCs凋亡的影响。将所有的实验结果进行综合分析,从而推导出TMP通过BK_(Ca)通道诱导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。 DMXAA小白鼠 结果: 1 STZ腹腔注射建立DM大鼠模型的结果 60只SD大鼠采用STZ一次性大剂量(55mg/kg)腹腔注射后,有46只成功建立了DM的模型,1只死亡,成模率为76.67%,死亡率为2.17%。 2 TMP对VSMCs上凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响 各组间c-myc、Bcl-2、Bax灰度值两两比较有差异(P＜0.01)。正常组的c-myc、Bcl-2、Bax表达最低;TMP低、高剂量组c-myc、Bcl-2表达低于DM模型组(P＜0.01),Bax的表达高于DM模型组(P＜0.01);TMP低、高剂量组间比较差异有意义(P＜0.01)。 3 TMP对VSMCs BK_(Ca)通道活动作用的结果 在DM早期,模型组、TMP低、高剂量组BK_(Ca)通道平均开放概率显著高于正常对照组、平均关闭时间显著低于正常对照组(P=0.000)。TMP低剂量组和高剂量组的NP_o显著高于DM模型组、T_c显著低于DM模型组(P=0.000),T_o四组间无差异(P＞0.05)。TMP高剂量组的NP_o高于低剂量组,T_c低于低剂量组,组间比较有意义(P=0.000)。 4 TMP和BK_(Ca)通道开放剂NS1619对体外培养的VSMCs增殖的影响 根据OD值计算出VSMCs的存活率,以对照组的细胞存活率为1,经单因素方差分析,模型组的细胞存活率最高＞1,表现为细胞增殖,与其余6组差异明显(P＜0.