无内毒素糖基化修饰的白蛋白(脂蛋白)制备与鉴定 1.无内毒素AGE-HSA的制备与鉴定 按文献方法体外制备无内毒素AGE-HSA修饰蛋白。将1.75g/L纯化的HSA分别置于含或不含0.1mol/L D-葡萄糖的0.4M磷酸盐缓冲液中,37℃孵育8周；用pH7.4磷酸盐缓冲液透析以除去葡萄糖。以在同样条件下不含葡萄糖的缓冲液中孵育8周的HSA作为对照,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌消毒后,制备的样本经荧光分光光度分析法鉴定,4℃无菌保存。所有制备AGE-HSA和未经修饰的HSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。 PFTα购买 2.无内毒素AGE-LDL的制备与鉴定 根据文献方法,将购买的LDL(2 mg protein/ml)和0.2M D(+)-glucose,以及抗氧化剂(1mg/ml EDTA和10μM BHT)混合均匀,无菌的氮气条件下,37℃孵育4周。制备出AGE-LDL在4℃,pH7.4无内毒素的PBS中透析24小时,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。制备的AGE-LDL与LDL比较(以LDL为标准)。使用trinitrobenzene sulphonic acid assay (TNBS法)检测游离蛋白含量(AGE-LDL
0.72±0.032AU VS. LDL 1.00±0.001AU, P0.05);琼脂糖凝胶电泳迁移率实验(AGE-LDL 1.18±0.32 VS. LDL 1.00±0.000, P>0.05);以上实验表明AGE-LDL制备成功。所有制备AGE-LDL和未经修饰的LDL经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。 二.人肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)的培养
人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞系)细胞购自美国ATCC库。细胞复苏后在37℃,5%CO2的条件下,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞长至70%-80%时,改用无血清培养基静置细胞16-24小时后用于实验。本研究使用6-10代细胞进行实验。倒置显微镜下观察细胞形态为铺路石样。 三.人肾小管上皮细胞系TLR-4受体的检测和定位 1.流式细胞仪检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体 收集处于对数生长期的HK-2细胞,固定后封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,PBS重悬细胞后,流式细胞仪检测。 2.免疫荧光检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体 人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的培养板上,待细胞生长至约70%融合,固定封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,碘化丙啶(PI)室温避光孵育染核,缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察、拍片。 四.AGE-LDL等诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6和IFN-β 人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入LDL(100μg/ml). HSA(100μg/ml).AGE-LDL(100μg/ml)和AGE-HSA(200μg/ml)刺激6小时,提取mRNA,qRT-PCR检测IL-6和IFN-β。或者刺激12小时,集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度。 五.AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的时间、浓度效应 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入25、50、100μg/mlAGE-LDL或100μg/ml未经修饰的LDL,于0、3、6、12及24小时收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 不 CAL-101 mRNA。或者收集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白量矫正。 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入或不加入10μg/ml多粘菌素B(PMX-B),孵育2小时候加入100μg/ml AGE-LDL或10gg/ml LPS,6小时后收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 mRNA。 六.TLR4介导AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6 1.TLR4 siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入LDL(100μg/ml)、AGE-HSA(200μg/ml)和AGE-LDL(100μg/ml),6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 2.TLR4中和抗体阻断后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化
人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入5μg/ml.1 Oμg/ml.20μg/ml兔抗人TLR4抗体或20μg/ml同源非免疫的兔IgG抗体,预孵2小时后,分别加入100μg/mlAGE-LDL,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 3.阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL诱导的HK-2细胞分泌IL-6 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别和TLR4中和抗体20μg/ml预孵2小时或者使用TLR4 SiRNA 100pmol干扰48小时后,加入AGE-LDL 100μg/m1孵育12小时,ELISA检测细胞上清中的IL-6蛋白的水平,并以蛋白浓度校正。 4. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、1、3、6、12及24小时收集细胞。Western-blot检测TLR4蛋白表达情况。 七.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4和下游Myd88/TRIF蛋白的影响 1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞Myd88和TRIF表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测Myd88和TRIF蛋白表达情况。 2. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μtg/ml LPS,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 3.