小鼠精原干细胞的分离和培养 采集新生6至12dpp小鼠睾丸，去除白膜，用胶原酶和DNA酶消化使SSCs与睾丸支持(Sertoli)细胞分离。传代SSCs使用不同溶液及因子组合筛选培养体系，最终确定DMEM+15%KSR+0.25μmol L-1A83-01为无血清无饲养层最佳培养体系。在该培养体系下细胞传代，通过形态学观察、计数结合PCR、免疫荧光染色、BrdU掺入染色、AP染色等检测方法，对分离的SSCs特性进行鉴定后证实：该培养体系能够维持小鼠SSCs的自我更新，证明所培养的精原干细胞为典型SSCs。 此网站 2.与小鼠精原干细胞发育密切相关的miR-34c靶基因的筛选、确定 通过miRwalk (miRNA靶基因预测)网站，得到一系列miR-34c可能直接作用的靶基因，从中选择了一个与小鼠SSCs发育及精子发生密切相关的Nanos2基因。通过构建含有Nanos2-3′UTR及miR-34c预测结合靶位点突变Mut-Nanos23′UTR的双荧光素酶报告基因载体，与miR-34c共转染Hela细胞，测定双荧光素酶发光值。结果证实Nanos23′UTR与miR-34c直接结合，这提示miR-34c可能通过靶向Nanos2发挥作用。

3. miR-34c在小鼠雄性精原干细胞精子发生过程中的作用 通过向SSCs中转染合成的miR-34c模拟物和抑制物，以及含有miR-34c慢病毒毒液的培养液培养小鼠曲细精管，通过qRT-PCR技术及免疫荧光染色、Western blot、曲细精管的Whole-mount staining等方法检测减数分裂相关基因的表达变化。检测结果发现，过表达miR-34c后，Nanos2表达特异性显著下调，Scp3、Stra8等减数分裂后期标记基因的表达明显上调。以上实验结果表明，miR-34c可促进小鼠SSCs向精子细胞分化。
正常生理和卵泡发育过程中，颗粒细胞分为卵巢颗粒细胞（mural granulosacell,mGCs）与卵丘颗粒细胞（cumulus cells,CCs），分别表达自身特有的转录。两者有着明确的分工：CCs影响卵母细胞成熟，而mGCs主要起内分泌功能。当卵丘卵母复合体（COCs）从卵泡中移除之后进行体外培养时，COCs与mGCs的分泌因子是相分离的。卵母细胞与其周围的颗粒细胞之间的通讯，对于卵母细胞发育以及颗粒细胞分化来说是至关重要的,卵母细胞依赖于分化了的CCs，CCs提供营养物质和调节信号来促进卵母细胞的核成熟以和质成熟以及发育能力的获得；另外卵母细胞可以促进颗粒细胞的增殖与分化以及相关基因的表达,在第一极体排出之后，一个对卵母细胞重新开始减数分裂的必须事件是卵丘颗粒细胞所发生的扩散，这对于排卵是重要的。在成熟过程中，卵丘颗粒细胞发生扩散现象，证明扩散现象与卵母细胞成熟有着某种关系，扩散现象是由于颗粒细胞自身与扩散相关基因的表达引起，而卵母细胞在扩散过程中也起到相当重要的作用。颗粒细胞为卵母细胞成熟提供一些分泌因子影响刺激成熟，反过来，卵母细胞成熟后分泌某种物质来刺激扩散。

所以 本研究的目的在于：（1）检测扩散的颗粒细胞中相关基因的表达情况；（2）加入GSK3抑制剂之后对卵母细胞成熟以及颗粒细胞扩散的影响；（3）GSK3抑制剂对颗粒细胞凋亡的影响。 结果：（1）扩散的颗粒细胞中，与扩散相关的基因如GDF9、HAS2、PTGS2、PTX3以及Tnfaip6基因均有表达；（2）在卵母细胞体外培养成熟成熟时加入BIO时，促进卵母细胞的成熟，但并不显著；对颗粒细胞的扩散有促进作用，正常情况下，用BSA配制的牛卵母细胞成熟培养液来培养卵母细胞时，颗粒细胞本不发生扩散，但是加入GSK3通用型抑制剂之后，颗粒细胞发生扩散，卵母细胞成熟情况与上述类似。（3）卵母细胞成熟之后脱颗粒，将收集的颗粒细胞单独培养时，分A/B两组，A组中加入BIO，B组为对照组，结果发现在短时间内两组细胞生长状况相似，但是随着培养时间的增加，会发现加入BIO的A组生长状况明显优于对照组。（4）GSK3抑制剂对颗粒细胞的凋亡有一定程度的减缓作用。 BI 2536体外 结论：颗粒细胞的生长、增殖、凋亡与GSK3基因有关，由于GSK3作为Wnt信号通路的一个重要节点，所以GSK3对Wnt信号通路起抑制作用，在这种情况下，Wnt信号通路被抑制，颗粒细胞只是单纯性的生长增殖但并未发生扩散，但是BSA培养液在加入GSK3抑制剂之后发生扩散，与在在血清培养液的情况下发生扩散一样，说明血清中有类似GSK3抑制剂的物质存在。加入GSK3抑制剂的培养体系中，卵母细胞在第一极体排出率上有一定上升，证明在正常情况下，GSK3抑制剂抑制GSK3之后，激活Wnt通路，对卵母细胞的成熟起稳定加成的作用。由于加入GSK3抑制剂的颗粒细胞在促凋亡Bax基因的表达量下降，而抗凋亡基因Bcl2表达量相差不大，促凋亡基因Bax的下降下降，说明抑制剂对Bax促凋亡基因的抑制作用更明显，抑制剂对颗粒细胞凋亡有抑制作用。所以，Wnt信号（GSK3抑制剂）对颗粒细胞的生长增殖期促进作用，对凋亡起缓解作用，反过来讲，可以概括为GSK3可以抑制颗粒细胞生长增殖，但对凋亡有一定程度的促进作用。
化疗耐药是临床上治疗肿瘤的关键障碍之一。卵巢癌是影响女性生存的恶性肿瘤之一，在临床治疗中，紫杉醇作为其治疗的一线药物，但由于发生耐药而降低其疗效。因此深入研究耐药发生机制尤为重要。本论文将从上皮间充质转化（EMT）与肿瘤干细胞的角度解释耐药性状发生及对细胞功能的改变，力求寻找出一条可调控卵巢癌细胞耐药发生的信号通路。

本课题以人卵巢癌细胞野生株（A2780/WT）和紫杉醇耐药株（A2780/PTX）为模型，通过药敏性检测，其对紫杉醇IC50分别为34.17μmol·L~(-1)和76.06μmol·L~(-1)； RT-PCR和免疫细胞荧光法检测EMT相关标志蛋白在两株细胞中的表达，结果显示A2780/PTX细胞与A2780/WT细胞相比，形态上由铺路石状转变成梭形，EMT相关分子标志物发生明显改变，上皮细胞标志物E-cadherin和Laminin5表达显著下调，间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin表达显著上调。细胞划痕及Transwell结果证明A2780/PTX细胞迁移能力增强，功能上改变与EMT的变化相符。这为选择卵巢癌耐药细胞株作为模型研究EMT与耐药发生机制探讨奠定基础。由于PI3K/Akt作为EMT发生信号通路，在多种肿瘤中均被激活。对A2780/PTX细胞添加PI3K/Akt抑制剂LY294002处理，采用MTT、RT-PCR、免疫细胞荧光染色、Transwell等方法，进行耐药指数检测、EMT标志物、细胞迁移及骨架结构改变等方面评价EMT的发生与肿瘤恶性程度的关系。结果表明：经过抑制剂LY294002处理，细胞发生EMT标志物逆转，迁移能力减弱，细胞对紫杉醇IC50下降为22.