01),W-7干预组表达减少,呈剂量依赖性(P＜0.05,P＜0.01)。 第二部分PTZ诱导的癫痫大鼠发作程度为Ⅳ-Ⅴ级,W-7保护组发作程度明显减轻,表现为Ⅰ-Ⅲ级发作(P＜0.05)。PTZ组脑组织LDH含量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),W-7保护组同PTZ组比较,LDH含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组织化学染色和免疫印记实验显示,PTZ组caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达明显增强(P＜0.01),三个剂量的W-7组表达明显减弱,其差异均具有显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。 结论 1 NMDA导致体外培养的乳鼠大脑皮质神经元NF-κBp65、p38MAPK蛋白表达增高,促进神经元凋亡。

2不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7可减轻NMDA诱导的皮质神经元的损伤,具有保护作用,其作用机制是通过抑制NF-κBp65、p38MAPK的蛋白表达实现的。 3 PTZ导致癫痫大鼠模型脑组织中caspase-3、NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达增高,提示PTZ癫痫模型可导致以凋亡为主的神经元损伤。 4不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7对PTZ诱导的癫痫大鼠具有保护作用,其作用机制是通过抑制caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK的蛋白表达实现的,可干预癫痫的发生和发展过程。
糖尿病(DM)是一种多病因的慢性代谢性疾病,糖尿病血管病变(DA)是糖尿病的一个重要并发症,是糖尿病病人各种器官病变的基础。DA可累及各级血管,表现为大血管过早发生动脉粥样硬化,血管舒缩功能障碍,血管平滑肌增生,微循环障碍,微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等。在良好的控制血糖水平的基础上,以DA发生发展的机制为切入点,选用药物阻断或减少加重DA发展的病理性因子或产物,成为目前防治DA的新热点。国外从细胞信号转导机制方面研究DA的发病机理,认为高血糖造成血管损伤的可能机制主要有:①多元醇旁路的激活,使代谢产物山梨醇增多,在细胞内积累,引起细胞渗透性损害和肿胀;②蛋白激酶C(PKC)激活,可对血管组织产生一系列不良效应,引起血管的结构与功能改变,与DA及其他糖尿病慢性并发症的发生密切相关;③蛋白质非酶糖化,形成AGEs,使胶原降解减少,基质增加,基底膜增厚,血管壁弹性减低,阻力增加,管腔狭窄;④氧化应激水平升高,对氧化损伤易感性增加,构成糖尿病患者在高血糖时发生慢性血管并发症的基础。西药治疗主要有PKC抑制剂、AGEs形成的抑制剂、醛糖还原酶活性抑制剂、抗氧化剂,上述药物的研发绝大多数还处在实验室阶段,其安全性和有效性还需动物和临床实验进一步证实。

许多 现代中医学者认为痰瘀互结是形成DA的主要原因,中医辨证主要分:气阴两虚型和阴阳两虚型;认为痰浊瘀血贯穿于DA发病的始终,活血化瘀,化痰散结是中医治疗DA的一个基本法则。川芎嗪(TMP)是从具有“血中气药”之称的活血化瘀中药川芎中提取出的有效单体,目前在临床上广泛用于治疗兼有血瘀证候的各种疾病,包括DA。 血管平滑肌细胞(VSMCs)是构成血管的主要细胞,其增殖导致血管重构,管腔变窄以及血管舒缩调节功能异常,是DA的主要病理改变之一。大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))在VSMCs上最为丰富,对平滑肌静息张力的维持和舒缩活动中起重要的调节作用。文献报导TMP可以直接显著增加VSMCs上的BK_(Ca)通道开放概率、缩短关闭时间,是TMP扩张血管的重要机制。此外TMP还能抑制体外培养的VSMCs增殖,促进其凋亡,降低抑制凋亡的相关基因c-myc的表达,使VSMCs处于G1期的细胞数显著增多,S期和G_2+M期的细胞数显著减少。TMP促进VSMCs凋亡与其开放BK_(Ca)通道之间是否存在关联,国内外目前鲜见此方面的研究报道,因此设计了本实验,并试图探讨TMP促进VSMCs凋亡的可能信号转导机制。

还有 目的:从整体水平观察TMP对糖尿病早期大鼠胸主动脉VSMCs上BK_(Ca)通道的作用,对凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响;从细胞水平研究TMP对VSMCs增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其促进BK_(Ca)通道介导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。 方法:采用链脲佐菌素(STZ)一次性大剂量腹腔注射,造成大鼠糖尿病模型。将大鼠分为正常对照组、DM模型组、TMP低剂量组、TMP高剂量组。正常对照组和DM模型组均每日腹腔注射注射用水;TMP低、高剂量组分别每日腹腔注射TMP 40mg/Kg,80mg/Kg。连续用药8周后,每组处死部分大鼠,取胸主动脉,采用原位杂交法检测胸主动脉VSMCs上c-myc、Bcl-2、Bax表达。剩余大鼠分批处死,取胸主脉,酶分离法,急性分离出单个血管VSMCs,采用细胞贴附式膜片钳记录模式,记录细胞上BK_(Ca)通道的开放电流,平均开放概率(NP_o),平均开放时间(T_o)、平均关闭时间(T_c)。体外培养胸主动脉VSMCs,PDGF-BB诱导细胞增殖,分别或联合加入TMP和BK_(Ca)通道开放剂NS1619,用MTT法检测两药对VSMCs生长的影响;另外对培养的细胞进行分组,分别或联合加入BK_(Ca)通道开放剂、阻断剂、一氧化氮供体、p38阻断剂、PKC抑制肽、TMP等,通过Hoechst33342荧光染色,计算VSMCs的凋亡率,经统计学处理后,对比上述药物对VSMCs凋亡的影响。将所有的实验结果进行综合分析,从而推导出TMP通过BK_(Ca)通道诱导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。 DMXAA小白鼠 结果: 1 STZ腹腔注射建立DM大鼠模型的结果 60只SD大鼠采用STZ一次性大剂量(55mg/kg)腹腔注射后,有46只成功建立了DM的模型,1只死亡,成模率为76.67%,死亡率为2.17%。 2 TMP对VSMCs上凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响 各组间c-myc、Bcl-2、Bax灰度值两两比较有差异(P＜0.01)。正常组的c-myc、Bcl-2、Bax表达最低;TMP低、高剂量组c-myc、Bcl-2表达低于DM模型组(P＜0.01),Bax的表达高于DM模型组(P＜0.01);TMP低、高剂量组间比较差异有意义(P＜0.01)。 3 TMP对VSMCs BK_(Ca)通道活动作用的结果 在DM早期,模型组、TMP低、高剂量组BK_(Ca)通道平均开放概率显著高于正常对照组、平均关闭时间显著低于正常对照组(P=0.000)。TMP低剂量组和高剂量组的NP_o显著高于DM模型组、T_c显著低于DM模型组(P=0.000),T_o四组间无差异(P＞0.05)。TMP高剂量组的NP_o高于低剂量组,T_c低于低剂量组,组间比较有意义(P=0.000)。 4 TMP和BK_(Ca)通道开放剂NS1619对体外培养的VSMCs增殖的影响 根据OD值计算出VSMCs的存活率,以对照组的细胞存活率为1,经单因素方差分析,模型组的细胞存活率最高＞1,表现为细胞增殖,与其余6组差异明显(P＜0.

hy926,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用MTT法确定细胞的增殖状态。 2.体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用不同终浓度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。 3.在96孔板上体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用CCK-8法确定细胞的增殖状态。 4.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用不同终浓度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。

Tie2 信号通路 研究结果 1.采用MTT法确定人脐静脉血管内皮细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.909±0.012, CLZ10μmo/L组0.904±0.026; CLZ30μmol/L组0.851±0.023; CLZ100μmol/L组0.670±0.013; CLZ300μmol/L组0.651±0.036。统计分析显示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分别能明显抑制HUVECs的增殖(P0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(86.7±1.6,77.9±2.3,P
研究目的:

本课题拟以人皮肤微血管内皮细胞株(human dermal microvascularendothelial cells,HMVECs)为研究对象,应用细胞生物学、单层内皮细胞通透性的测定、免疫印迹和激光共聚焦显微镜观察等实验方法和技术,观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)修饰的人血清白蛋白(humanserum ICG 001 albumin,HSA)对HMVECs骨架纤维状肌动蛋白(filamentous actin,,F-actin)形态和定位的影响,以及对单层细胞通透性的作用;选用RhoA的主导失活或组成型激活的重组腺病毒以及ROCK抑制剂处理细胞,探讨Rho/ROCK通路是否参与了AGE-HSA介导的上述细胞反应;通过免疫印迹检测RhoA和ROCK蛋白及其磷酸化水平的变化,查明RhoA、ROCK的磷酸化激活在其中的作用;为了探讨Rho/ROCK介导AGE-HSA引起内皮细胞形态和功能变化的机制,分别观察了抑制ROCK对p38 MAPK磷酸化水平的影响,以及抑制p38 MAPK磷酸化激活对RhoA、ROCK磷酸化激活的影响。通过上述研究试图阐明AGE-HSA对血管内皮细胞形态和功能的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGE-HSA相关的糖尿病微血管并发症发生发展的机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。 研究方法: AGE-HSA由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。体外培养人皮肤微血管内皮细胞株,分别接种于微孔小皿(petri dish)、双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5 mm,孔径大小0.4μm)和6 cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合后,换无血清培养基继续培养2 h使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。在各实验分组中,分别用ROCK特异性抑制剂Y-27632、H-1152或p38MPAK丝裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制剂SB203580预处理细胞30 Wnt抑制剂 min后,即以不同时间或者浓度的AGE-HSA再孵育;另外,用重组腺病毒RhoA N19的无活性型突变体预转染内皮细胞24 h,继以AGE-HSA再孵育;或重组腺病毒RhoA L63的活性突变体单独转染细胞24 h。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin、RhoA及其磷酸化蛋白的结构及分布改变;用免疫印迹法检测phospho-p38,RhoA和ROCK及其磷酸化水平的变化,采用多功能蛋白组学影像系统KODAK2000R直接成像,以ImageJ软件分析各组灰度值,β-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较;用FITC荧光标记蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,实验结果以Pa变化百分比表示,Pa%=(实验样品Pa值/对照样品Pa值)×100。

研究结果: 1.AGE-HSA对HMVECs骨架F-actin形态和单层内皮细胞通透性的影响 (1) AGE-HSA对HMVECs细胞骨架F-actin形态的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs骨架肌动蛋白F-actin结构和分布的改变,未经修饰的人血清白蛋白无此作用;正常细胞的F-actin主要分布在细胞周边,线条光滑,完整连续,界限分明。随着AGE-HSA作用时间或浓度的增加,F-actin变得毛糙不规整,出现锯齿样结构,甚至断裂、变细、崩解消散,F-actin在细胞内弥散分布,由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维逐渐增多,细胞变圆、明显回缩,相邻细胞互相解离,细胞间失去正常连接结构。 (2) AGE-HSA对HMVECs通透性的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs通透性的升高。在时间效应组中,HMVECs的通透性随AGE-HSA作用时间的延长显著增高(F=186.746,P＜0.01),当AGE-HSA作用1,2,4,8,12 h时,与对照组相比,HMVECs的通透性分别增至113.97±2.68%,149.31±2.48%,169.76±6.21%,191.32±2.14%,196.14±2.43%,且从2 h起,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。在剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,HMVECs的通透性显著增加(F=344.582,P＜0.01),对照组内皮细胞的通透性为100%,当AGEs为12.5,25,50,100μg/ml时,Pa与对照组相比分别增至117.95±0.99%,152.15±4.51%,191.32±2.14%,199.23±2.54%,且从12.5μg/ml起均与对照组有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。未经修饰的HSA对内皮细胞通透性(101.57±1.29%)无明显影响,差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.

CD8+Treg、NKTTreg和双阴性Treg细胞四大类。其中,CD4+CD25+Treg细胞是目前研究最为广泛的Treg细胞。CD4+CD25+Treg细胞除表达CD25分子外,还表达一系列免疫调节相关的标志物,如细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic

selleck screening library T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR)家族相关基因和细胞核内的叉头／翼状螺旋转录因子P3(Forkhad box P3, Foxp3)。Foxp3是Treg细胞维持自身免疫平衡所必需的分子。体内和体外实验都已证明,转化生长因子β1(Transforming growth factor β, TGF-β1)可诱导CD4+T细胞表达Foxp3,形成具有免疫抑制功能的Treg细胞。 丫δ T细胞因其表面表达由γ链和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor, TCR)而得名,在抗原识别和免疫应答中具有特殊的作用。γδT细胞主要分布于皮肤、小肠、肺和生殖器官等粘膜及皮下组织,而在人类外周血中,TCR γδ约表达于0.5%-10%的CD3+T细胞表面。γδ T细胞又根据δ链的不同分为V81T细胞和V82T细胞两种类型。Vδ1T细胞多位于小肠上皮组织中,是小肠上皮内淋巴细胞(Intestine intraepithelial lymphocytes, iIELs)的重要组成部分,而其在外周血中的数量仅为γδT细胞总量的20%；V82T细胞主要见于外周血,约占γδT细胞总量的70%。Vδ2T细胞具有显著的细胞毒性作用和对微生物重复感染的记忆反应功能。由于人类外周血中V81T细胞含量较少,并且体外扩增存在一定难度,因此对外周血中Vδ1T细胞的生物学特性和功能知之甚少。iIELs主要位于小肠绒毛柱状上皮内,为一类组织松散的浸润性淋巴细胞。iIELs由于数量众多并在粘膜免疫防御中具有重要作用,因而成为IELs研究的热点之一。iIELs的表型和功能呈现多样性,依据表面TCR组成的不同分为αβ T细胞和γδ T细胞。前者具有显著的细胞毒活性,因而参与小肠粘膜的免疫应答反应；后者的功能尚未完全明确,但已有的研究显示该细胞功能具有多样性,包括免疫防御、细胞毒活性等。而最近更多的研究显示,γδT细胞具有免疫调节潜能。因此,本文将针对这一科学问题展开相关研究。

本研究旨在验证人外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMCs)来源的Vδ1T细胞以及小鼠iIELs来源的γδ T细胞是否具有免疫调节功能。根据以上研究内容,本论文分为两部分。第一部分通过在有或无外源性转化生长因子β1(TGF-β1)的情况下,检测抗TCR 没有 Vδ1单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)扩增的、人PBMCs来源的V81T细胞内Foxp3的表达情况。结果显示,即使无外源性TGF-β1,抗TCR Vδ1mAb亦可扩增获得大量Foxp3+V81T细胞,且Foxp3分子在V81T细胞中稳定表达。应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent

assay, ELISA)检测抗TCR Vδ1mAb扩增的PBMCs上清中是否存在TGF-β1。结果显示,培养上清中存在较高水平的TGF-β1。应用流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测发现V81T细胞是TGF-β1的主要来源细胞,且V81T细胞表达较高水平的TGF-β1受体(CD105)。接下来我们检测了Foxp3+Vδ1T细胞所表达的其它Treg细胞相关的表面标志物和细胞因子。结果显示,V81T细胞可表达GITR、CTLA-4、CD25等Treg细胞常见的表面分子和白介素-10(interleukin-10, IL-10)、TGF-β1。最后我们应用CFSE方法检测发现, CD25high V51T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上研究结果提示,Foxp3+Vδ1T细胞是一种Treg细胞。这为某些肠上皮的炎症性疾病的发病和治疗、移植免疫免疫耐受机制的研究奠定了基础。 本论文的第二部分通过分离获得C57BL/6J小鼠的iIELs,经TGF-β1和γδTCR抗体(antibody, Ab)共同作用后,应用流式细胞技术检测γδ Trametinib T细胞内Foxp3分子的表达情况。结果显示,TGF-β1和γδ TCR抗体可以共同诱导Foxp3+γδ T细胞的产生。同时,我们应用CFSE染色的方法检测发现,Foxp3+γδ T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上结果表明,TGF-β1和γδ TCR抗体在体外能够共同诱导小鼠的iIELs产生Foxp3+γδ T细胞,并且该细胞具有免疫调节功能。这为阐明TGF-β1在小肠上皮免疫调节性γδ T细胞产生中的作用,以及某些小肠自身免疫性疾病的发病机制和治疗提供了线索。
尽管心血管疾病的治疗方法现已取得了很大的进展,但是各种心脏疾病导致的心力衰竭在全球仍然具有很高的发病率和死亡率。心力衰竭是一种由多因素引起的疾病,内在的分子机制还不是很清楚,但很可能与潜在的基因和蛋白质表达改变有关。本研究室前期通过对终末期心力衰竭患者心肌组织的基因组学筛选发现转化生长因子结合蛋白2(Latent TGF-β binding protein2, LTBP-2)表达显著升高(7.

天狼猩红染色胶原含量的变化 6周时,各组大鼠心肌纤维化面积均有不同程度的提高。MIR组大鼠心肌存在广泛的心肌纤维化,且心肌纤维化面积明显高于1周组(P＜0.05)。SMC的治疗明显改善了大鼠的心肌纤维化,且呈剂量依赖性,大剂量组优于小剂量组。应用p38MAPK抑制剂(SB组)明显降低心肌纤维化的面积,与SMC治疗组比较差异无显著性(P＞0.05)。与MIR组比较,SMC+LY组大鼠心肌纤维化程度也有降低,但降低水平明显小于舒脉胶囊治疗组与SB组。

8.透射电镜观测心肌超微结构变化 Sham组大鼠心肌肌原纤维排列整齐、紧密,无断裂,肌丝清晰,细胞核发育良好,线粒体体积大数量多,嵴丰富排列紧密呈Z字型,肌浆网体积大,数量多,胞浆丰富。MIR组大鼠心肌细胞肿胀、肌原纤维排列紊乱,核异形、呈分叶状,核膜已染色质边聚,常染色质呈团块状,Z线消失,核周细胞器呈点状、碎片状等变化;多数线粒体呈多形性,大小不等、嵴断裂溶解呈现絮状、空泡样变。SMCH与SB203580组心肌肌原纤维大都排列整齐,未见肌丝溶解,肌浆网扩张减少;线粒体无明显肿胀;细胞核轻度肿胀。SMCL组与SMC+LY组局部心肌细胞核异型;线粒体形状不规则;核周有点状、碎片状改变。 结论 1.舒脉胶囊对MI大鼠左室重构有明显的逆转作用,其具体表现为:改善MI大鼠心肌组织形态学指标,降低心肌CFs增殖与ECM胶原含量,即降低心肌α-SMA与collagenⅠ的表达,降低心肌纤维化,改善心肌超微结构的病理改变。 2.舒脉胶囊改善左室重构的分子机制为舒脉胶囊抑制p38MAPK信号通路,从而抑制心肌TNFα的蛋白表达。进而下调TIMP-1及αSMA的蛋白表达,抑制CFs的增殖与胶原的沉积。 3.舒脉胶囊改善左室整体与局部心功能。表现为左室射血分数(LVEF)的提高,左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)的降低,左室缺血区室壁厚度分数(WT%)的提高。心功能改善是舒脉胶囊对缺血心肌保护作用的终极指标。
目的：PI3K/Akt在肿瘤细胞生长、增殖及血管新生等生物学行为中起重要作用。然而,其与肿瘤血管生成拟态形成的关系不明确。本研究拟初步探索PI3K与肺癌血管生成拟态的关系。 HSP抑制剂 方法：收集我院2007年1月-2008年4月肺腺癌手术病例47例及良性肺疾病组织11例,免疫组化法检测各组织中Akt、p-Akt的表达；CD31免疫组织化学及PAS组织化学双重染色法检测各肺癌组织中是否存在血管生成拟态；统计学分析p-Akt阳性表达与肺癌中VM现象的关系； 结果：肺癌组织中Akt表达阳性率为80.8%(38/47),p-Akt表达阳性率为76.5%(36/47),肺良性病组织中Akt及p-Akt表达阳性率分别为27.3%(3/11)和18.2%(2/11),肺癌组织中Akt及p-Akt的阳性表达率显著高于良性肺疾病组织(p
目的：利用荧光素酶报告基因系统,确定人p55PIK基因启动子全长序列和启动子核心序列；利用生物信息学技术,分析并预测人p55PIK基因启动子核心序列中可能影响转录活性的顺式作用元件；利用定点突变技术,观察上述DNA位点对p55PIK的转录活性的影响,明确哪些位点及相应转录因子在p55PIK的转录调节中起重要作用。

此网站 方法：以从正常人基因组DNA作为模板,用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)法扩增基因组DNA人p55PIK基因5’端非编码区DNA不同长度片段,分别克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体得到(-651/+45)-p55PIK、(-839/+45)-p55PIK、(-1064/+45)-p55PIK、(-1243/+45)-p55PIK和(-1633/+45)-p55PIK；在HepG2、Hela细胞中,利用荧光素酶报告基因法检测各片段DNA序列的报告基因活性,确定人p55PIK基因启动子活性最强的全长序列和活性变化最大的启动子核心序列；利用生物信息学方法,分析这一启动子核心序列并预测可能与之结合的转录因子和相应的顺式作用元件；利用定点突变技术结合荧光素酶报告基因检测技术,明确哪些位点及相应转录因子对p55PIK转录活性其重要作用。 结果：构建得到p55PIK基因上游调控区不同长度片段的荧光素酶报告基因载体(-651/+45)-p55PIK、(-839/+45)-p55PIK、(-1064/+45)-p55PIK、(-1243/+45)-p55PIK和(-1633/+45)-p55PIK,酶切及测序鉴定分子量及序列正确；观察各质粒的相对荧光素酶活性,HepG2中(-1243/+45)-p55PIK的相对荧光素酶活性分别为4.90±0.21,p0.05)

结论：人p55PIK基因的启动子全长片段位于(-1243/+45),其核心片段位于(-1243/-840)；其中若干DNA位点可能与MZF1、YY1、RUNX1、ADR1、IRF1、Delta E、p300等转录因子结合并调节p55PIK基因的转录；位于p55PIK基因的启动子(-900/-896)的” selleck合成 TGGGGA “位点可能与MZFl蛋白结合显著影响p55PIK基因启动子的转录水平。 目的：阐明MZF1在p55PIK转录调控中的作用及其机制,并观察该作用对肿瘤细胞增殖的影响。 方法：我们利用染色质免疫共沉淀法验证了MZF1蛋白与p55PIK启动子(-900/-896)位点的TGGGGA序列DNA之间的结合,阐明MZF1对p55PIK的转录调控作用的具体机制。我们分别在肿瘤细胞系中高表达、低表达了MZF1蛋白。用荧光素酶报告基因系统、荧光定量PCR法和Western Blot免疫印迹法分别检测了p55PIK基因的转录水平、mRNA水平和蛋白表达水平的变化,阐明p55PIK是否受MZF1的转录调控；利用BrdU掺入法检测了细胞DNA合成能力,利用Ki67法检测了细胞增殖相关抗原的表达,p55PIK接受MZF1蛋白的转录调控对肿瘤细胞增殖的影响。在该作用的临床意义方面,我们利用荧光定量PCR法,检测了10例结直肠癌患者的肿瘤标本和正常组织标本中的MZF1和p55PIK的mRNA水平,分析了二者的表达的变化及相关性,阐明p55PIK表达与MZF1的表达的相关性,以及p55PIK在结直肠肿瘤发生发展中的作用及意义。 结果：MZF1 Antibody组和Input组均有明显的条带,而阴性对照IgG组则无明显条带。GFP-MZF1质粒组的p55PIK全长相对荧光素酶活性显著高于GFP空质粒组(P<0.01,LOVO中P<0.

07倍,提示SKBR3/TDR对MK-2206无耐药性。不同浓度的MK-2206与trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明显,差异具有统计学意义(P0.05)(图7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR细胞内的蓄积。3. Western Blot检测结果显示MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。与对照组相比,不同浓度的MK-2206处理SKBR3/TDR和SKBR3细胞后,均可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达,且呈剂量依赖性(图8、图9),实验组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明了联合应用trastuzumab和MK-2206的有效性。结论通过建立裸鼠HER2阳性乳腺癌模型及相关动物实验,结果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。MK-2206与trastuzumab联合应用可以下调p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌trastuzumab耐药。P-PRAS40-Thr246是一个新型的乳腺癌治疗靶点,为逆转trastuzumab耐药的研究提供帮助。
目的：肝细胞肝癌(Hepatocellular

点击此处 carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一,在男性癌症死亡率中居于第二位。肝脏切除、肝移植、局部消融等治疗方式使肝癌的治愈成为可能,但多数肝癌患者有肝硬化背景,在发现时已经处于病程的中晚期,仅有30%～40%的患者适合该治疗,且其术后5年的复发率高达70%。介入化疗栓塞等只能暂时缓解肝癌患者的临床症状,并不能有效显著改善患者的预后。索拉菲尼(sorafenib),一种多蛋白激酶抑制剂,具有抗血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重作用,是治疗进展期肝癌的一线用药。但是由于肝癌复杂的生物学特性,通过其内在的或获得的机制造成对索拉菲尼的耐药,导致索拉菲尼治疗进展期肝癌效果极其有限。但索拉菲尼治疗失败后尚无有效的化疗药物可以应用,因此探讨索拉菲尼耐药的机制对于改善进展期肝癌患者的预后显得迫切和重要。在中国,大约75%的肝癌患者患有乙型病毒性肝炎,持续的慢性肝脏损伤刺激星形细胞和成纤维细胞,形成肝脏的纤维化,纤维化最终发展为肝硬化。肝硬化破坏了肝脏正常的血液供应,导致肝脏血流循环减少,形成局部缺氧的微环境；从肝脏一般性腺瘤样增生、不典型腺瘤样增生到早期癌的演变中,细胞的快速增殖也会造成肿瘤局部缺氧。索拉菲尼在抑制肿瘤新生血管生成的同时,又加重了肿瘤内部的缺氧。而肿瘤内部的缺氧微环境(hypoxic

microenvironment)加剧了肿瘤细胞基因的不稳定性并诱导肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)相关蛋白的表达,造成肿瘤对化疗和放疗的耐受。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)是肿瘤缺氧反应中的关键因子,其通过调控肿瘤能量代谢、新生血管形成、增殖、浸润和转移等相关基因的转录和表达,决定着肿瘤的发生发展。因此下调缺氧诱导因子、促进它的降解或抑制它的功能等,都可以阻断缺氧诱导反应,达到抑制肿瘤的效果。HIF是由α亚单位和p亚单位组成的异构二聚体,属于碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子家族成员。HIF主要包括HIF-1α和HIF-2a,尽管二者有48%的同源氨基酸序列,结构相似,但其不同之处正在不断被发现。HIF-la在急性缺氧环境下被激活并稳定表达,但随着缺氧时间的延长其蛋白表达水平逐渐降低直至消失,相反HIF-2a的含量随着缺氧时间的延长持续增加。缺氧诱导的基因如VEGF在急性缺氧期是HIF-1a的靶基因,而随着缺氧时间的延长主要由HIF-2a激活。与HIF-1a广泛分布不同,HIF-2a仅能在特定细胞如肝细胞内表达。肝细胞内的血管生成素基因主要由HIF-2a调控,而灭活HIF-2a可以抑制VHL相关肝血管瘤的生长。同HIF-1a相比,HIF-2a可能在肝癌发生发展中发挥更加重要作用,是治疗肝癌的一个潜在靶点。就HIF-2a在肝癌发生发展中的作用人们做了初步的探讨,多数研究认为HIF-2a促进肝癌的发生发展,然而也有少数研究提示HIF-2a对肝癌的进展具有负调节作用,表明HIF-2a在肝癌发生发展中的作用存在争议,这从另一方面也反映了HIF-2a在肝癌发生发展中的作用机制是复杂的。研究表明,肿瘤特异性的缺氧微环境可能与索拉菲尼的耐药相关,但其确切的机制尚未完全阐明。因此,我们设计实验研究HIF-2a在肝癌发生发展中的作用,探索缺氧微环境下索拉菲尼的耐药机制,这样不仅可以进一步完善肝癌发生发展分子机制理论,而且有望为提高索拉菲尼治疗肝癌的疗效提供潜在的靶点。方法：1.应用免疫组织化学及免疫印迹方法检测肝癌肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721中HIF-2a蛋白的表达,分析HIF-2a蛋白表达水平与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系。2.既往的研究表明：缺氧培养的肝癌细胞系同常氧培养相比其索拉菲尼IC50显著增高,提示缺氧增加了肝癌细胞系对索拉菲尼的抵抗。为进一步研究是HIF-1a还是HIF-2a影响了缺氧微环境下肝癌对索拉菲尼的治疗效果,本课题应用Western

AUY922 为什么 blot观察索拉菲尼治疗前后肝癌细胞系中HIF-1α、HIF-2a的表达。体外实验和裸鼠成瘤实验观察HIF-2a封闭前后索拉菲尼对肿瘤细胞增殖能力的影响,探讨HIF-2a在索拉菲尼耐药中的作用。3.采用细胞免疫化学和TOP-Flash荧光素酶报告实验观察HIF对Wnt/β-catenin经典信号通路活性的影响。4.采用基因干扰技术检测HIF-2α封闭前后及c-Myc封闭前后Wnt/β-catenin通路中关键蛋白的表达,分析缺氧环境中HIF-2α表达与Wnt/β-catenin信号通路间的关系。Western blot分析肝癌移植瘤模型中对照组、索拉菲尼治疗组、HIF-2α shRNA组及联合组中HIF-2α、Wnt/β-catenin通路中关键基因的表达,深入探讨缺氧微环境中索拉菲尼耐药的分子机制。结果:1. Western blot分析发现,肝癌组织中HIF-2α的蛋白表达水平明显高于癌旁组织中HIF-2a的蛋白表达水平(P<0.05)。与HIF-1α不同,HepG2细胞经索拉菲尼处理后其HIF-2α蛋白的表达量较未处理组增加1.7倍,经统计学检验,具有统计学意义(P<0.

00％(21／28)，而在26例骨软骨瘤中表达阳性细胞百分比为30.77％(8／26)。软骨肉瘤P38蛋白表达与作为对照组的骨软骨瘤相比差异具有统计学意义(p＜0.05)；P-P38在软骨肉瘤的患者中阳性细胞百分比为67.86％(19／28)，在骨软骨瘤中阳性细胞百分比为26.92％(7／2 6)，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 结论 P38蛋白在软骨肉瘤中表达明显增高，差异具有统计学意义，提示P38蛋白可能与软骨肉瘤的发生、发展和侵袭密切相关。
目的

肝脏的缺血再灌注(ischemia reperfusion injury,IRI)是一个临床常见的病理生理过程,出现在失血性休克、中毒性休克、肝移植、肝切除等许多临床过程中。缺氧后,对器官恢复血流灌注所形成的损伤,严重影响着休克后复苏的效果和肝移植术后的肝脏生存率。因此,缺血再灌注损伤的研究,对促进缺血后器官功能的恢复具有重要意义。 FGFR phosphorylation 肝脏缺血再灌注损伤是一个复杂的多因素过程。氧自由基(oxygen free radical,OFR)形成、钙超载、微循环衰竭等都参与了这个复杂的过程。 血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)是血红素降解的起始酶和限速酶,能在体内分解血红素生成一氧化碳(carbon monoxide,CO)、胆绿素(biliverdin)和游离铁(free iron)。近年来研究发现,HO 及其代谢产物还参与了对抗氧化应激、调节血管张力、信号传递、抗细胞增殖等多种生理过程,其中HO 在应激反应中表达,并对组织起着保护作用。 有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一个与氧化应激有关的重要通路,其中P38在应激中起着重要的作用。研究P38

与肝脏缺血再灌注损伤及与HO-1 哪里 的关系有助于阐明HO-1 作用机制。 本研究旨在通过分别用血红素氧合酶-1(HO-1)的诱导剂(hemin)和抑制剂(ZnPP)来研究血红素氧合酶—一氧化碳系
目的 建立UVB(45mJ/cm~2)对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的病理模型,探讨在UVB辐射下,扇贝多肽(PCF)对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的保护作用及机制。方法 MTT法检测胸腺淋巴细胞活性;测定胞浆超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)和过氧化氢酶(CAT)的活性;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的产生以及细胞的凋亡率。透射电镜观察细胞超微结构的改变;琼脂糖凝胶电泳观察各组不加入或分别加入ERK抑制剂、JNK抑制剂和P38抑制剂后的DNA ladder;western-blot检测磷酸化ERK、磷酸化JNK、和磷酸化P38的活性。结果 PCF能显著提高UVB辐射后小鼠胸腺淋巴细胞的活性;提高胞浆中SOD、GSH-px、CAT的活性,降低ROS含量及细胞凋亡率;抑制UVB辐射所致的胸腺淋巴细胞凋亡的形态学改变,维持细胞的正常超微结构;抑制UVB所致的胸腺淋巴细胞DNA片段的出现;预先应用ERK抑制剂使DNA片段增加,给予JNK和P38抑制剂后协同PCF使DNA片段带减少。PCF还能提高磷酸化ERK的活性但降低磷酸化JNK及磷酸化P38的活性。结论 PCF能提高体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞的活性,抑制UVB辐射诱导的细胞凋亡,对UVB辐射损伤的细胞具有保护作用。其作用机制与PCF能提高抗氧化酶的活性、减低活性氧的产生,减少DNA断裂有关,此外PCF对胸腺淋巴细胞的部分保护作用可能是通过调节MAPK的信号转导级联通路实现。
目的:通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者和大鼠肺内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶B(PKB)与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达,研究MAPK、PKB通路和γ-GCS的关系及其在COPD发病中可能的参与机制,从而为防治COPD这一顽固性疾病找到新的靶点。

方法:分动物实验和临床实验。1.动物实验:健康雄性Wistar大鼠28只,随机分COPD模型组和对照组,每组14只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入脂多糖(LPS)法制作COPD大鼠模型。测定大鼠肺功能并观察大鼠肺组织病理形态学改变;检测大鼠肺组织中γ-GCS活性,原位杂交检测肺组织中γ-GCSmRNA的表达,免疫组化和western印迹分析肺组织中γ-GCS与磷酸化的细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38MAPK、PKB蛋白水平。2.临床实验:手术切除肺癌患者肺组织标本18例,所有患者术前均行肺功能检测,COPD诊断采用中华医学会2002年制定的标准,其中COPD组和对照组各9例,检测肺组织中γ-GCS活性,原位杂交检测肺组织中γ-GCS PF-573228临床试验 mRNA的表达,免疫组化分析肺组织中γ-GCS与磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、PKB蛋白水平。 结果 1.COPD组大鼠PEF和FVE_(0.3)较对照组降低(P<0.

0m A,滤板0.25mm Cu和1.0mm Al,靶皮距60cm,剂量率0.40 Gy·min–1;4CCK8(cell counting Kit-8)和集落形成方法检测细胞存活及细胞辐射敏感性;5GFP-LC3细胞模型和MDC染色检测自噬通量(autophagy flux);6Western blot检测蛋白表达水平变化;7免疫共沉淀(IP)检测蛋白间相互作用;8流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果:1.IR诱导自噬和ATM Ser1981位点的磷酸化经过8Gy IR诱导Hela细胞和H1299细胞,Western blot结果显示,MAPLC3-II/MAPLC3-I比值呈剂量依赖性(0Gy,2Gy,4Gy和8Gy)和时间依赖性(4h,8h,16h和24h)增加,其中8Gy IR后16-24h比值最高;Hela和H1299细胞构建GFP-LC3细胞模型,8Gy IR诱导后,细胞中可见明显的自噬空泡;Hela细胞和H1299细胞分别经8Gy IR诱导后,MDC方法检测自噬阳性细胞率分别从17.32%增加到54.77%和7.83%增加到25.93%。以上三种实验结果共同提示IR诱导Hela细胞和H1299细胞自噬激活。同时,Western blot结果显示:与假照组相比,ATM

Ser1981位点的磷酸化在8Gy IR后30min迅速达到最高水平,4h恢复到基础水平。2.抑制ATM下调MAPK14表达进而抑制MAPKAPK2磷酸化在Hela细胞和H1299细胞中构建ATM和MAPK14沉默细胞模型。通过western 已经 blot验证,沉默ATM后,MAPK14表达水平下调,但沉默MAPK14不影响ATM表达水平。同时在H1299细胞中,沉默MAPK14明显下调其下游靶基因MAPKAPK2表达水平。提示MAPK14很可能是ATM下游靶基因之一。另外,ATM抑制剂KU55933在抑制ATM磷酸化的同时使MAPKAPK2磷酸化水平显著下降。提示ATM调控MAPK14-MAPKAPK2信号通路。3.抑制ATM和MAPK14增加辐射敏感性不同剂量IR处理Hela细胞和H1299细胞前2h,分别给予用ATM磷酸化抑制剂KU55933

Rucaparib研究购买 100n M和700n M预处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与DMSO对照组相比,KU55933预处理的Hela细胞和H1299细胞D0分别为3.59 vs 3.02和2.21 vs 1.59,D0值均明显降低。Hela和H1299细胞的ATMRi和MAPK14Ri细胞模型经过不同剂量IR处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与Psuper空载体组比较,D0值分别降低(Hela-ATMRi:2.77 vs 2.13;Hela-MAPK14Ri:2.77 vs 2.19;H1299-ATMRi:2.07 vs 1.44;H1299-MAPK14Ri:2.07 vs 1.52)。以上结果提示,抑制ATM或MAPK14增加辐射敏感性,且两者可能处在调控辐射敏感性的同一个通路。4.抑制ATM和MAPK14不影响IR诱导的凋亡与假照组相比,Hela和H1299沉默细胞模型经8Gy IR处理后24h检测通过流式细胞术检测凋亡水平,空载体Psuper组、ATMRi组和MAPK14Ri组细胞中,凋亡水平均有所增加,分别为8.61%vs 12.5%、8.57%vs

14.08%、9.26%vs 13.88%和6.1%vs 10.2%,5.1%vs 11.8%,5.3%vs 9.8%,但三组之间凋亡水平的增加程度没有差异,提示沉默ATM和MAPK14并没有影响IR诱导的凋亡。5.抑制ATM和MAPK14降低Hela细胞中IR诱导的自噬水平首先在Hela细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。经8Gy IR处理后24h,Western blot检测蛋白表达水平,灰度分析并计算MAPLC3II/MAPLC3I比值。DMSO对照组MAPLC3II/MAPLC3I比值呈剂量依赖性增加(0Gy:1.00,2Gy:1.46,4Gy:1.36和8Gy:1.93),而100n M KU55933提前2h预处理后各组MAPLC3II/MAPLC3I比值(0Gy:1.92,2Gy:2.05,4Gy:2.08和8Gy:1.40)无明显增加。与DMSO组细胞比较,单独KU55933处理使基础MAPLC3比值增加(1.00 无 vs 1.92),但8Gy IR联合KU55933处理使MAPKLC3比值降低(1.92vs 1.40);同时,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组含自噬空泡阳性细胞率增加了124%,而经KU55933预处理后仅增加了34.2%;另外,MDC方法检测自噬阳性细胞率得到类似的结果(202%vs 35.72%)。三种结果共同提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制Hela细胞中IR诱导自噬的水平。然后在Hela沉默细胞模型中进一步验证ATM和MAPK14的作用。8Gy IR诱导后24h,Western blot检测蛋白水平变化。与假照组相比,空载体Psuper组、ATMRi组、MAPK14Ri组细胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分别为1.00 vs 2.71、0.75 vs 0.81和1.19 vs 0.91;同时,MDC阳性细胞率分别增加了为272%,53.18%和24.76%。以上结果表明沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制Hela细胞中IR诱导的自噬水平。6.抑制ATM和MAPK14降低H1299细胞中IR诱导的自噬水平在H1299细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。一方面,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组细胞含自噬空泡阳性细胞率增加了129%,经700n M KU55933预处理后仅增加了29.

原代培养的小胶质细胞，免疫荧光标记显示其CD11b阳性率＞90%,符合后续实验要求。免疫荧光双重标记染色表明小胶质细胞表达P2Y12受体蛋白，其阳性主要分布于小胶质细胞膜和胞浆内。 点击此处 2.P2Y12受体激动剂，2MeSADP作用于小胶质细胞可促进其[Ca2+]i升高，而在预孵育P2Y12特异性阻断剂AR-C660962min后，2MeSADP诱发的小胶质细胞[Ca2+]i反应完全被抑制。 3.100μM2MeSADP刺激小胶质细胞24hr后可以诱导小胶质细胞活化，引起小胶质细胞表面形态的改变，而预孵育AR-C66096可以抑制这一效应。

4.100μM2MeSADP作用于小胶质细胞1hr后，培养液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度显著增加，而AR-C66096可以抑制这种作用。 5.移除细胞外Ca2+后，100μM2MeSADP刺激小胶质细胞1hr后，其培养液IL-1β浓度与未移除细胞外Ca2+相比较有所降低。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、磷脂酶C（phospholipase C，PLC）拮抗剂新霉素后，再加入2MeSADP，其培养液IL-1β浓度与未孵育GDPβS、新霉素时相比有所下降。预先孵育100μM蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）抑制剂H-89后再加入2MeSADP，培养液中IL-1β浓度与未孵育H-89时未见明显变化。 6.移除细胞培养基中的Ca2+后，100μM2MeSADP作用于小胶质细胞1hr后，其培养液中TNF-α与未移除细胞外Ca2+相比明显下降。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素、PKA阻断剂H-89以及p38MAPK通路阻断剂SB203580后，培养液上清中TNF-α与未孵育GDPβS、新霉素、H-89、SB203580时相比有所降低。而预先加入100μM蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）阻断剂Che后，再加入2MeSADP（终浓度100μM），其培养基上清中TNF-α浓度与未孵育Che时没有明显变化。 第三章： 1.原代培养小胶质细胞，免疫荧光双重标记表明小胶质细胞表达P2X7受体蛋白，其阳性主要分布于小胶质细胞膜和胞浆内。 2.100μM BzATP作用小胶质细胞24hr后可以诱导小胶质细胞活化，引起小胶质细胞表面形态的改变,而预孵育BBG可以抑制这一效应。 3.100μM BzATP作用于小胶质细胞1hr后，培养液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度显著增加。而BBG可阻断此作用。 4.在缺乏细胞外Ca2+的环境中,100μM BzATP作用于小胶质细胞1hr后，其培养液中IL-1β浓度与未移除细胞外Ca2+相比明显降低。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素后，再加入后再加入BzATP，其培养液IL-1β浓度与未孵育GDPβS、新霉素时相比未见明显改变。而预孵育100μM PKA阻断剂H-89后再加入BzATP，其培养液IL-1β浓度与未孵育H-89时则出现显著下降。

5.移除细胞培养基中的Ca2+后，100μM BzATP作用于小胶质细胞1hr后，其培养液中TNF-α与未移除细胞外Ca2+相比明显下降。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素以及p38MAPK通路阻断剂SB203580后，培养液上清中TNF-α与未孵育GDPβS、新霉素、SB203580时相比未见明显改变。而预孵育100μMPKA抑制剂H-89、PKC阻断剂Che后，再加入BzATP（终浓度100μM），其培养基上清中TNF-α浓度与未孵育Che时出现明显下降。 这个 第四章： 1.每日鞘内给予P2Y12受体激动剂2MeSADP，从给药3d开始，大鼠下肢痛阈开始出现明显降低，并伴有相关痛行为；至给药第7d达到最低值，停止给药后，痛阈曲线逐渐恢复至正常水平。在同时给予P2Y12受体拮抗剂AR-C66096+2MeSADP或单独给予P2Y12受体拮抗剂AR-C66096或PBS时，均未见大鼠痛阈出现明显改变。而在CCI模型大鼠鞘内给予AR-C66096后，则可以观察到大鼠痛阈下降趋势明显缓解并且与同时间CCI大鼠痛阈相比有明显提升，提示AR-C66096可以通过抑制P2Y12受体缓解CCI大鼠疼痛。 2.给予P2Y12受体激动剂2MeSADP的大鼠，L4~6段脊髓背角浅层CD11b阳性细胞数及光密度值均高于PBS对照组，且给药7d组，明显高于其他组别。CCI-14d大鼠脊髓背角小胶质细胞明显活化，CD11b阳性细胞数及平均光密度均高于对照组，CCI+AR-C66096组大鼠脊髓背角CD11b平均光密度与手术组相比显著降低。

3.每日鞘内给予P2X7受体激动剂BzATP，从给药第3d开始，大鼠出现明显的痛相关行为，检测痛阈发现大鼠下肢痛阈开始显著下降；至给药第7d达到最低值，停止给药后，痛阈曲线逐渐恢复至正常水平。在同时给予P2X7受体拮抗剂BBG+BzATP或单独给予P2X7受体拮抗剂BBG或PBS时，均未见大鼠痛阈出现明显改变。在CCI模型大鼠鞘内给予BBG后，可以观察到大鼠痛阈下降趋势明显缓解，与同时间CCI大鼠痛阈相比有明显提升，提示BBG可以通过抑制P2X7受体缓解CCI大鼠疼痛。 GSI-IX 4.给予P2X7受体激动剂BzATP的大鼠，L4~6段脊髓背角浅层CD11b阳性细胞数及光密度值均高于PBS对照组，且给药7d组，明显高于其他组别。CCI-14d大鼠脊髓背角小胶质细胞显著活化，CD11b阳性细胞数及平均光密度均高于对照组，而CCI+BBG组大鼠脊髓背角CD11b平均光密度与手术组相比明显降低。 结论： 1.P2Y12受体、P2X7受体均表达于原代培养的小胶质细胞表面，参与介导原代小胶质细胞的活化；2MeSADP激活P2Y12受体后诱发小胶质细胞[Ca2+]i升高； 2.2MeSADP可促进小胶质细胞释放IL-1β、TNF-α，这一效应是由P2Y12受体参与介导，受到细胞外Ca2+浓度影响，还受到PLC的调控，而不受PKC的影响； 3.BzATP可促进小胶质细胞释放IL-1β、TNF-α，这一效应是由P2X7受体参与介导，受到PKA调控，并受细胞外Ca2+浓度影响，而不受G蛋白和PLC的影响； 4.鞘内给予P2Y12受体激动剂或P2X7受体激动剂，大鼠热痛阈和机械痛阈均明显降低；脊髓背角CD11b表达显著增加； 5.

利用PC-PLC特异性抑制剂D609,研究PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用 1)用MTT方法,检测D609的细胞毒性作用。 2)PC-PLC活性检测。 3)ELISA检测炎性细胞因子TNF-а、IL-1β的活性,来评价PC-PLC在小胶质细胞活化中作用 4)利用硝酸还原酶法,检测炎性介质NO含量变化。 4. PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用机制 1)用Western blot方法,检测p38 MAPK、JNK、ERK蛋白磷酸化水平。 2)利用一氧化氮合酶(NOS)试剂盒,检测iNOS活性。

结果 1. BV2小胶质细胞培养通过倒置相差显微镜观察,BV2细胞成簇分布,胞体较小,胞浆浓缩,折光性强,清晰明亮。 2. LPS可激活小胶质细胞 2.1 LPS刺激BV2细胞形态学变化观察结果使用1μg/ml LPS处理BV2细胞24h,细胞形态出现明显变化,细胞胞体形态由正常的阿米巴样变为扁平状,胞体变大,较铺展,突起明显减少或者无突起,细胞多数悬浮。 2.2 LPS能够有效的诱导小胶质细胞活化本研究用ELISA法检测发现1μg/ml PKA inhibitors LPS刺激BV2细胞24h后,处理组细胞产生并释放大量的炎性因子TNF-α,与正常对照细胞升高约10倍,差异显著(P<0.01)。炎性因子IL-1β升高2倍,差异显著(P<0.01),而结构型cNOS活性变化不明显。用D609预处理阻断PC-PLC活性,能够明显抑制iNOS活性的升高(P
目的探讨SHR和2K1C两型高血压模型血管重构形式是否相同。检测MAPK家族成员ERK1/2、上游调解激酶MEK1/2以及下游底物CPLA2在两型高血压模型中主动脉和肾脏血管平滑肌细胞中的表达特点,对比研究ERK1/2信号通路在两型高血压模型血管平滑肌细胞增殖/凋亡中的作用及调节途径,进一步明确高血压血管平滑肌细胞变化的分子机制。 方法5周龄的雄性Wistar kyoto大鼠(WKY)36只,随机分为两肾一夹型高血压组(简称2K1C组,18只)和假手术正常血压对照组(简称SHAM组,12只)以及空白对照组(简称CON组,6只)。2K1C组大鼠用直径0.25mm的银夹部分夹闭左肾动脉,关闭切口。SHAM组仅分离出左肾动脉,不做其它处理,作为假手术对照组;空白对照组不做任何处理。术后各组大鼠分别观察至8周龄、16周龄和24周龄。SHR大鼠不做特殊处理,分别于8周龄(简称SHR8组,6只),16周龄(简称SHR16组,6只)和24周龄(简称SHR24组,6只)处死,迅速提取肾脏和胸主动脉,一半置于4%中性多聚甲醛溶液固定,行HE和免疫组化染色。另一半置于-80℃冰箱中冻存用于Western-blotting检测。目镜测微尺测量两型高血压大鼠各周龄主动脉和肾脏细小动脉血管中膜厚度/血管内径比值,免疫组织化学和Western 以及 blot方法对比研究两型高血压大鼠主动脉、肾脏细小动脉平滑肌细胞中p-ERK1/2、p-MEK1/2及CPLA2的表达。 结果1、血压变化:2K1C组大鼠造模一周后血压明显升高(P<0.01),随后稳定保持在较高水平(192.58±12.92mmHg)。SHR从8周龄组开始血压升高,随着周龄增加SHR组血压逐渐升高,18周龄后,SHR组血压明显高于2K1C组(P<0.01或P<0.01),SHR各周龄组肾小球损伤率均明显高于同周龄2K1C组(P<0.05或P<0.05)。5、CPLA2检测情况:SHR和2K1C主动脉、肾脏细小动脉平滑肌细胞CPLA2表达均明显高于同周龄假手术组(P<0.05或P<0.01)。相同周龄SHR和2K1C比较,2K1C8和16周龄组叶间动脉CPLA2表达明显高于相应SHR组(P<0.05),SHR8、16、24周龄组小叶间动脉CPLA2表达明显高于相应2K1C组(P<0.05或P
目的:研究α肾上腺素能受体激动对人外周血单核细胞TLR4信号通路及其中相关因子变化影响,探讨α肾上腺素能受体与TLR4的相互作用及其调控机制。

方法:采集健康青年人外周静脉血,进行离体实验。(一)观察不同剂量α受体激动剂去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)对人外周血单核细胞TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、NF-κBp65的影响及上清中炎症因子IL-6、IL-18的变化,选取10例健康青年人各抽取外周静脉血32ml,经EDTA抗凝后每份血均分为空白组、25μmol/L去甲肾上腺组、50μmol/L去甲肾上腺组、75μmol/L去甲肾上腺组,孵育18h后,用ELISA法测定血液离心后上清液中IL-6、IL-18的浓度,分离单核细胞后用流式细胞仪测定CD14+单核细胞TLR4阳性细胞百分率,提取RNA后采用RT-PCR测定TLR4mRNA及P38mRNA的表达,免疫组化法测定NF-κBp65蛋白的表达;(二)利用siRNA干扰技术使TLR4mRNA保持静默,观察用α受体激动剂NE刺激后相关因子浓度变化情况,选取10例健康人各抽取外周静脉血16ml,经EDTA抗凝后每份血均分为空白组、75μmol/L去甲肾上腺组、1nmol Scramble siRNA+0.24ml转染液组、1nmol TLR4 siRNA+0.24ml转染液组,转染18h后用ELISA法测定血液离心后上清液中IL-6、IL-18的浓度,分离单核细胞后爬片培养,免疫组化法测定NF-κBp65蛋白的表达。(三)利用不同阻滞剂分别阻断α受体、P38MAPK、PKA、PKC后,再用α受体激动剂NE刺激,观察TLR4蛋白表达量的变化,选取10例健康青年人各抽取外周静脉血6ml,经EDTA抗凝后每份血均分为25μmol/Lα受体阻滞剂酚妥拉明组、15μmol/L 那个 P38MAPK抑制剂SB 202190组、15μmol/L pKA抑制剂H89组、15μmol/L pKC抑制剂Go6983组,并设空白对照组、75μmol/L去甲肾上腺组,孵育0.5h后,再加入75μmol/LNE孵育18h后,采用流式细胞仪测定CD14+单核细胞TLR4阳性细胞百分率。 结果:1、应用不同浓度的α受体激动剂NE刺激人外周血单核细胞后,TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、核内NF-κBp65蛋白、上清中IL-6及IL-18的表达呈剂量依赖性升高:NE75组、NE50组分别与空白组及NE25组比较均明显升高,(p<0.05,p<0.01),NE75组与NE50组比较明显升高(p0.05);2、TLR4mRNA干扰后α受体激动剂NE刺激血液离心后上清液中IL-6及IL-18、单核细胞NF-κB P65蛋白的表达为:Si+NE75组均明显低于空白组、Sc+ NE75组及NE75组(P0.

共计74例病例入组,其中男38例(51.35%),女36例(48.65%),男女比例为1.05:1;年龄跨度4岁半-48岁,未成年42例(56.75%),成年3(243.25%)例;缺血型病例62例(83.78%),出血型病例12例(16.22%)。74例患者均行双侧EDAS术,共148侧例手术半球。EDAS术后复查DSA时间为3个月-55个月,平均15.1个月。本组病例在性别构成上男性稍多于女性;年龄构成上未成年患者较成年患者更多;发病类型构成上缺血型多于出血型。术前头颅MR显示,148侧例手术半球中存在脑缺血的共计98侧例;术前头部PET显示,148侧例手术半球中存在脑糖代谢异常的共计106侧例;术前头颅DSA显示,148侧例手术半球中铃木分期Ⅰ期14侧例,铃木分期Ⅱ期21侧例,铃木分期Ⅲ期38侧例,铃木分期Ⅳ期33侧例,铃木分期Ⅴ期28侧例,铃木分期Ⅵ期14侧例;148侧例脑半球中存在颈外动脉颅内代偿的共计92侧例。

因为 2.本组病例术前头颅DSA检查结果显示:74例烟雾病患者共148例侧手术半球中存在颈外动脉颅内代偿的共92侧例半球,其中74侧例左半球中存在颈外动脉颅内代偿的共50例侧半球,74侧例右半球存在颈外动脉颅内代偿的共42例侧半球。92侧例有代偿的半球中,通过上颌动脉向颅内代偿共2例;通过上颌动脉+枕动脉向颅内代偿共1例;通过上颌动脉+脑膜中动脉向颅内代偿共1例;通过脑膜中动脉向颅内代偿共53例;通过脑膜中动脉+颞浅动脉向颅内代偿共9例;通过脑膜中动脉+枕动脉向颅内代偿共9例;通过脑膜中动脉+枕动脉+颞浅动脉向颅内代偿共1例;通过脑膜中动脉+枕动脉+上颌动脉向颅内代偿共1例;通过颞浅动脉向颅内代偿共7例;通过枕动脉向颅内代偿共6例;颞浅动脉与枕动脉沟通后共同向颅内代偿2例。脑膜中动脉颅内代偿在所有代偿途径中所占比重最大,占所有代偿途径的57.6%。 3.74例患者均行双侧EDAS术,共148例侧手术半球,血管重建效果0级共32侧例半球;Ⅰ级26侧例半球;Ⅱ级38侧例半球;Ⅲ级52侧例半球。 4.铃木分期对烟雾病自发性颈外动脉颅内代偿形成有显著影响(P
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见且致残率极高的严重危害人类身心健康的系统性自身免疫性疾病。其病理上的特征表现为滑膜细胞的“肿瘤样”增生、炎性细胞浸润、血管翳的形成以及关节软骨和骨的进行性破坏。RA的发病机制十分复杂,涉及多种细胞、多个细胞因子以及多条信号通路之间的相互作用,尽管人类在过去的数十余年里对RA的病理生理进行了广泛而深入的研究,也取得了突破性的进展,但其发病机制至今尚不完全清楚。因而有必要对RA的发病机制进行更深一步的研究与探索,寻找到更多新的可能的治疗靶标。

白细胞介素-32(interleukin-32, IL-32)是新发现的一种存在六种或更多剪接变异体的炎性细胞因子。研究发现,IL-32高表达于RA滑膜的活组织检测中,而在骨关节炎的滑膜组织中没有检测到IL-32的表达。IL-32可通过多条信号转导途径,促进细胞分化,参与细胞凋亡,诱导其他致炎细胞因子和趋化因子的生成,在炎症反应、心血管疾病和自身免疫性疾病等方面发挥着重要作用。IL-32γ是最长的剪接变异体,且表现出最强的生物活性。本研究通过体外实验,探究IL-32γ对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的增殖和分泌的影响以及其信号调节途径。通过MTT的方法发现了IL-32γ促进RA-FLS增殖的最佳浓度为100ng/ml。通过细胞免疫组化的方法发现IL-32γ是通过NF-κB信号通路来促进FLS增殖。采用流式细胞术检测IL-32γ对RA-FLS增殖的细胞周期的影响,发现它是通过促进S期向G2期转换来促进细胞增殖的。用RT-PCR的方法检测了在培养基中加入了IL-32γ刺激后对RA-FLS中IL-6表达量的影响,用同样的方法检测了在分别加入SB203580(p38MAPK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(Erk1/2抑制剂)三种MAPKs信号通路的抑制剂30min后再在培养基中加入IL-32γ刺激后对RA-FLS中IL-6表达量的影响,结果表明IL-32γ可以促进IL-6的表达,但加入这三种抑制剂后发现只有加了PD98059后IL-6的表达量减少了,说明IL-32γ是通过激活Erk1/2信号途径来上调IL-6表达量。

更多 此工作为探究IL-32在RA的炎症反应过程中的作用及其可能的作用机制打下了基础,从而为RA的治疗提供理论基础、实验依据和新的可能的治疗靶标。
目的:初步探讨Gas6在预适应中对大鼠心肌细胞缺氧|复氧损伤的保护作用及机制。 Danusertib 花费 方法:选择心肌细胞株H9C2建立实验模型,实验分为5组:①正常对照组:正常培养H9C2细胞;②缺氧复氧组:缺氧2h,再复氧24h;③预适应组:先缺氧20min,再复氧45min,随后再缺氧2h,再复氧24h;④加外源性重组人生长停滞特异性蛋白6(rhGas6)组:加入终浓度为100ng/ml的rhGas6,余同缺氧复氧组;⑤Gas6+LY294002组:加入终浓度为100ng/ml的rhGas6和终浓度为10umol/L的PI3K通路阻断剂LY294002,余同缺氧复氧组。应用流式细胞术测细胞凋亡率,测LDH活性了解心肌细胞受损程度;real time -PCR法测Gas6mRNA表达;免疫印迹法测(Western blot)测定磷酸化Akt、FoxO3a蛋白的表达。 结果:预适应组Gas6 mRNA表达高于缺氧复氧组(P〈0.05);与缺氧复氧组对比,预适应组和Gas6组LDH的活性及细胞凋亡率明显降低(P〈0.05), p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达明显增高(P〈0.05);与Gas6组对比,Gas6+LY294002组LDH的活性及细胞凋亡率明显增加,p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达明显减少(P〈0.